Revvity, 63ADK019PEG, Kit de detección de IR-β total (receptor de insulina β) HTRF, 500 puntos de ensayo

Descripción general
El ensayo del receptor de insulina ß total permite detectar dicho receptor. Estimulado por la insulina y los factores de crecimiento similares a la insulina, el receptor de insulina participa en diversas vías, como las de señalización de la insulina y FoxO.
Los ensayos HTRF ofrecen muchas ventajas sobre otras tecnologías:

Formato homogéneo de adición y lectura
Sin pasos de lavado
Fondo bajo
Miniaturización sencilla desde microplacas de 96 o 384 pocillos a formatos de ensayo de alta densidad, como placas de 384 pocillos de bajo volumen y de 1536 pocillos.
Señal estable, que proporciona flexibilidad en el tiempo de lectura o tamaño de los ensayos.
Cómo funciona
Principio del ensayo del receptor de insulina total ß
El ensayo del Receptor de Insulina ß Total cuantifica el nivel de expresión del Receptor de Insulina ß en un lisado celular. A diferencia del Western Blot, este ensayo se basa completamente en placa y no requiere geles, electroforesis ni transferencia. El ensayo del Receptor de Insulina ß Total utiliza dos anticuerpos marcados: uno acoplado a un fluoróforo donante y el otro a un aceptor. Ambos anticuerpos son altamente específicos para un epítopo específico de la proteína. En presencia del Receptor de Insulina ß en un extracto celular, la adición de estos conjugados acerca el fluoróforo donante al aceptor, generando así una señal de FRET. Su intensidad es directamente proporcional a la concentración de la proteína presente en la muestra y permite evaluar la expresión de proteínas en un formato de ensayo sin lavado.

Protocolo de ensayo de 2 placas del receptor de insulina total ß
El protocolo de 2 placas implica el cultivo celular en una placa de 96 pocillos antes de la lisis. Posteriormente, se transfieren los lisados ​​a una placa de detección de bajo volumen de 384 pocillos antes de añadir los reactivos de detección del receptor de insulina total ß HTRF. Este protocolo permite monitorizar la viabilidad y la confluencia de las células.

Protocolo de ensayo de placa del receptor de insulina ß1 total
La detección del receptor de insulina β total con reactivos HTRF se puede realizar en una sola placa utilizada para cultivo, estimulación y lisis. No requiere lavado. Este protocolo, diseñado por HTS, permite la miniaturización manteniendo una calidad HTRF robusta.

Ilustración de IRβ total (Tyr1150/1151) en HepaRG
Las células HepaRG se sembraron a 200.000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos. Tras una incubación de 5 días a 37 °C y 5 % de CO2, se añadió una dilución seriada de insulina bajo las células en presencia de pervanadato a 30 µM durante 5 minutos a 37 °C y 5 % de CO2. Se retiró el medio de estimulación de las células y se añadieron 50 µL de tampón de lisis. La lisis se realizó mediante agitación suave durante 30 minutos. Se transfirieron 16 µL de muestras a una placa de pequeño volumen de 384 pocillos y, a continuación, se añadieron 4 µL de reactivos de detección de IRβ HTRF fosforilada. Paralelamente, se dispensaron 16 µL en otros pocillos y se añadieron 4 µL de reactivos de detección de IRβ HTRF totales. Las señales se registraron durante la noche.

Comparación de WB con IRβ total
Se cultivaron células humanas Hek 293 hasta alcanzar una confluencia del 80 %. Tras el cotratamiento con insulina y pervanadato, se lisaron las células y se recogieron los sobrenadantes solubles mediante centrifugación. Se realizaron diluciones seriadas del lisado celular y se transfirieron 16 µL de cada dilución a una microplaca blanca de bajo volumen de 384 pocillos antes de añadir finalmente los reactivos del kit celular HTRF IRβ fosforilado. Una comparación en paralelo mostró que el ensayo HTRF fosforilado es al menos 8 veces más sensible que el Western blot. Aplicación: Señalización celular.
Marca-HTRF
Modalidad de detección-HTRF
Modificación molecular total
Kit de grupo de productos
Volumen de muestra: 16 µL
Condiciones de envío - Envío en hielo seco
Clase objetivo: fosfoproteínas
Tecnología-TR-FRET
Área terapéutica - Metabolismo/Neurociencia de la diabetes
Tamaño de la unidad: 500 puntos de ensayo