Revvity, 64CDK1T4PEH, kit de detección de fosfo-CDK1 (Thr14) humana y de ratón HTRF, 10 000 puntos de ensayo

Descripción general
Este ensayo basado en células HTRF detecta de manera conveniente y precisa el CDK1 fosforilado en Thr14.
La CDK1 (quinasa dependiente de ciclina 1) pertenece a la subfamilia de las CDK que coordinan la progresión del ciclo celular en células de mamíferos (incluidas también CDK1, CDK4 y CDK6). La CDK1 es una subunidad catalítica de una proteína quinasa denominada factor promotor de la fase M, que induce la entrada en mitosis. La CDK1 promueve la transición G2-M y regula el progreso de G1 y la transición G1-S mediante la asociación con múltiples ciclinas en interfase (ciclina A, ciclina B). La fosforilación en Thr14 y Tyr15, que resulta en la inhibición de la CDK1, puede ser realizada por las proteínas quinasas Wee1 y Myt1. La fosfatasa cdc25 podría ser responsable de la eliminación de fosfatos en Thr14 y Tyr15 y la posterior activación de la CDK1.
La fosforilación inhibidora de CDK1 en Thr14 es esencial para mantener la integridad del genoma y prevenir el daño al ADN durante la fase S. Por lo tanto, el eje Wee1/Cdc25A es un objetivo atractivo para la terapia contra el cáncer y podría representar un enfoque único para sensibilizar las células cancerosas con CDK1 hiperactiva.
Cómo funciona
Principio del ensayo de fosfo-CDK1 (Thr14)
El ensayo Phospho-CDK1 (Thr14) mide la presencia de CDK1 fosforilada en Thr14. A diferencia del Western Blot, este ensayo se basa completamente en placa y no requiere geles, electroforesis ni transferencia. El ensayo utiliza dos anticuerpos: uno marcado con un fluoróforo donante y el otro con un aceptor. El primer anticuerpo se seleccionó por su unión específica al motivo fosforilado de la proteína, y el segundo por su capacidad para reconocer la proteína independientemente de su estado de fosforilación. La fosforilación de la proteína permite la formación de un inmunocomplejo que involucra a ambos anticuerpos marcados, lo que acerca el fluoróforo donante al aceptor, generando así una señal de FRET. Su intensidad es directamente proporcional a la concentración de proteína fosforilada presente en la muestra y permite evaluar el estado de fosforilación de la proteína en un formato de ensayo sin lavado.

Protocolo de ensayo de dos placas de fosfo-CDK1 (Thr14)
El protocolo de dos placas consiste en cultivar las células en una placa de 96 pocillos antes de la lisis y, posteriormente, transferir los lisados ​​a una placa de detección de bajo volumen de 384 pocillos antes de añadir los reactivos de detección HTRF de Fosfo-CDK1 (Thr14). Este protocolo permite monitorizar la viabilidad y la confluencia de las células.

Protocolo de ensayo de una placa de fosfo-CDK1 (Thr14)
La detección de CDK1 fosforilada (Thr14) con reactivos HTRF se puede realizar en una sola placa utilizada para cultivo, estimulación y lisis. No requiere lavado. Este protocolo, diseñado por HTS, permite la miniaturización manteniendo una calidad HTRF robusta. Aplicación: Señalización celular.
Marca-HTRF
Modalidad de detección-HTRF
Compatibilidad del tampón de lisis: tampón de lisis 1, tampón de lisis 4
Modificación molecular-fosforilación
Kit de grupo de productos
Volumen de muestra: 16 µL
Condiciones de envío - Envío en hielo seco
Clase objetivo: fosfoproteínas
Especie objetivo: ratón humano
Tecnología-TR-FRET
Tamaño de la unidad: 10 000 puntos de ensayo