Revvity, 64UBIS65PEH, kit de detección de fosfoubiquitina (Ser65) humana y de ratón HTRF, 10 000 puntos de ensayo

Descripción general
El ensayo celular de fosfoubiquitina (Ser65) está diseñado para monitorizar el nivel de la forma fosforilada de la cadena de ubiquitina. La ubiquitina es una proteína de 76 aminoácidos (8,5 kDa) de expresión ubicua y altamente conservada, con una identidad de secuencia de aminoácidos del 100 % entre humanos y ratones.
La fosforilación de la ubiquitina es un paso clave en el control de calidad de las mitocondrias mediante la interacción Parkin/PINK-1. Parkin es una ubiquitina ligasa E3 que conjuga la ubiquitina con proteínas mitocondriales deterioradas, lo que provoca la degradación de orgánulos. PINK1 es una quinasa Ser/Thr que se acumula únicamente en mitocondrias deterioradas y fosforila dos sustratos: el dominio similar a la ubiquitina de Parkin y las cadenas de ubiquitina.
Las funciones amplificadas de la ubiquitina dependientes de Parkin/PINK-1 actúan como señal para el secuestro y la degradación de las mitocondrias dañadas (mitofagia). La desregulación de esta señalización está relacionada con algunas formas de la enfermedad de Parkinson.
La despolarización de las mitocondrias por agentes desacopladores, como CCCP y valinomicina, hace que PINK1 se acumule en la membrana mitocondrial externa y desencadene la producción de fosfoS65-ubiquitina.
Cómo funciona
Principio del ensayo de fosfoubiquitina (Ser65)
El ensayo de fosfoubiquitina (Ser65) mide la ubiquitina cuando se fosforila en Ser65. A diferencia del Western Blot, este ensayo se basa completamente en placa y no requiere geles, electroforesis ni transferencia. Utiliza dos anticuerpos: uno marcado con un fluoróforo donante y el otro con un aceptor. El primer anticuerpo se seleccionó por su unión específica al motivo fosforilado de la proteína, mientras que el segundo por su capacidad de reconocer la proteína independientemente de su estado de fosforilación. La fosforilación de la proteína permite la formación de un inmunocomplejo que involucra a ambos anticuerpos marcados, lo que acerca el fluoróforo donante al aceptor, generando así una señal de FRET. Su intensidad es directamente proporcional a la concentración de proteína fosforilada presente en la muestra y permite evaluar el estado de fosforilación de la proteína en un formato de ensayo sin lavado.

Protocolo de ensayo de dos placas de fosfoubiquitina (Ser65)
El protocolo de dos placas consiste en cultivar las células en una placa de 96 pocillos antes de la lisis y, posteriormente, transferir los lisados ​​a una placa de detección de bajo volumen de 384 pocillos antes de añadir el tampón de activación y, posteriormente, los reactivos de detección HTRF de fosfoubiquitina (Ser65). Este protocolo permite monitorizar la viabilidad y la confluencia de las células.

Protocolo de ensayo de una placa de fosfoubiquitina (Ser65)
La detección de ubiquitina fosforilada (Ser65) con reactivos HTRF se puede realizar en una sola placa utilizada para cultivo, estimulación y lisis. No requiere lavado. Este protocolo, diseñado por HTS, permite la miniaturización manteniendo una calidad HTRF robusta. Aplicación: Señalización celular.
Marca-HTRF
Modalidad de detección-HTRF
Compatibilidad del tampón de lisis: tampón de lisis 1, tampón de lisis 3, tampón de lisis 4, tampón de lisis 5
Modificación molecular-fosforilación
Kit de grupo de productos
Volumen de muestra: 16 µL
Condiciones de envío - Envío en hielo seco
Clase objetivo: fosfoproteínas
Especie objetivo: ratón humano
Tecnología-TR-FRET
Área terapéutica-Neurociencia
Tamaño de la unidad: 10 000 puntos de ensayo