Revvity, ALSU-AMYD-A50K, kit de detección de dímeros humanos MyD88 AlphaLISA, 50 000 puntos de ensayo

Descripción general
Los homodímeros de MYD88 representan el estado oligomérico inicial en el ensamblaje del complejo de señalización middosoma, que transduce las señales de los TLR y los IL-1R. Tras la activación del receptor, las moléculas de MYD88 experimentan cambios conformacionales que promueven las interacciones con el dominio de muerte y la formación de dímeros. Los dímeros de MYD88 sirven como sitios de nucleación para la oligomerización de orden superior que recluta y activa las quinasas de la familia IRAK. Las mutaciones oncogénicas de MYD88 L265P potencian la dimerización de MYD88 y la formación espontánea de middosomas, lo que impulsa la señalización crónica de NF-κB en neoplasias malignas de células B. Dirigir la dimerización de MYD88 representa una estrategia terapéutica para los linfomas con mutación en MYD88.
AlphaLISA SureFire Ultra Human MyD88 Dimer es un inmunoensayo tipo sándwich para la detección cuantitativa del dímero MyD88 en lisados ​​celulares, utilizando tecnología Alpha.
Formatos:

El kit HV (alto volumen) contiene reactivos para ejecutar 100 pocillos en formato de 96 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 60 μL.
El kit de 500 puntos contiene suficientes reactivos para ejecutar 500 pocillos en formato de 384 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 20 μL.
El kit de 10 000 puntos contiene suficientes reactivos para ejecutar 10 000 pocillos en formato de 384 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 20 μL.
El kit de 50.000 puntos contiene suficientes reactivos para ejecutar 50.000 pocillos en formato de 384 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 20 μL.

Los kits AlphaLISA SureFire Ultra son compatibles con:

Lisados ​​de células y tejidos
Moduladores de anticuerpos
Anticuerpos bioterapéuticos

Los kits AlphaLISA SureFire Ultra se pueden utilizar para:

Ensayos de quinasas celulares
Estudios de activación de receptores
Cribado de alto rendimiento para estudios preclínicos
Cómo funciona
Principio del ensayo de detección de dímeros/agregados de proteínas AlphaLISA SureFire Ultra
El ensayo de dímeros/agregados AlphaLISA SureFire Ultra mide los niveles de una proteína determinada en forma dimérica, multimérica o cualquier otra forma agregada.
El ensayo utiliza un único clon de anticuerpo marcado con el péptido CaptSure™ y biotina, que reconoce los epítopos expuestos en la proteína diana multivalente. Los ensayos AlphaLISA requieren dos tipos de microesferas: microesferas aceptoras y microesferas donadoras. Las microesferas aceptoras están recubiertas con un agente CaptSure patentado para inmovilizar específicamente el anticuerpo marcado con una etiqueta CaptSure. Las microesferas donantes están recubiertas con estreptavidina para capturar el mismo anticuerpo específico, que está biotinilado. En presencia de la proteína multivalente, ambos anticuerpos acercan las microesferas donadoras y aceptoras, por lo que el oxígeno singlete transfiere energía para excitar la microesfera aceptora, lo que permite la generación de una señal alfa luminiscente. La cantidad de luz emitida es directamente proporcional a la cantidad de proteína multimérica presente en la muestra.

Protocolo de ensayo de dos placas para la detección de dímeros y agregados AlphaLISA SureFire Ultra
El protocolo de dos placas implica el cultivo y tratamiento de las células en una placa de 96 pocillos antes de la lisis, y la posterior transferencia de los lisados ​​a una placa Optiplate de 384 pocillos antes de añadir los reactivos de detección AlphaLISA SureFire Ultra para dímeros o agregados. Este protocolo permite monitorizar la viabilidad y la confluencia de las células. Además, los lisados ​​de un solo pocillo pueden utilizarse para medir múltiples dianas.

Protocolo de ensayo de una placa para la detección de dímeros/agregados de proteínas AlphaLISA SureFire Ultra
La detección del dímero o agregado con reactivos AlphaLISA SureFire Ultra se puede realizar en una sola placa, utilizada para cultivo, tratamiento y lisis. No requiere lavado. Este protocolo, diseñado para HTS, permite la miniaturización, manteniendo la robusta calidad de AlphaLISA SureFire Ultra.
Sensibilidad del ensayo
Sensibilidad del ensayo: dilución del lisado celular
El lisado celular se preparó a partir de células Karpas 299 a una concentración de 2 x 106 células/ml y se estimuló con 10 ng/ml de IL-1b durante 10 minutos en HBSS + BSA al 0,1 %. Las células se lisaron añadiendo tampón de lisis 5X durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación.
El lisado se diluyó en serie en tampón de lisis y los niveles de dímero MyD88 se evaluaron con AlphaLISA SureFire Ultra. Para la detección, se transfirieron 10 µL de lisado a una placa OptiPlate blanca de 384 pocillos, seguidos de 5 µL de mezcla aceptora y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Finalmente, se añadieron 5 µL de mezcla donadora a cada pocillo y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en oscuridad. La placa se leyó en un Envision con la configuración estándar de AlphaLISA.
Se indica el número aproximado de células por punto de datos. La línea punteada representa el fondo del ensayo. El ensayo puede detectar el dímero MyD88 hasta 500 células por punto de datos.
Aplicación: Señalización celular
Compatible con automatización: Sí
Marca AlphaLISA SureFire Ultra
Modalidad de detección alfa
Tiempo de protocolo: 2 h a temperatura ambiente
Volumen de muestra: 10 µL
Condiciones de envío - Envío en Blue Ice
Objetivo-MyD88
Clase objetivo: fosfoproteínas
Especie objetivo: humanos
Tecnología-Alfa
Área terapéutica-Inflamación
Tamaño de la unidad: 50 000 puntos de ensayo