Revvity, ALSU-CIR1MYD-A500, kit de detección del complejo humano IRAK1/MyD88 AlphaLISA, 500 puntos de ensayo

Descripción general
El complejo IRAK1/MYD88 constituye la plataforma de señalización inicial para las vías TLR e IL-1R, y sirve como base para la activación inmunitaria innata. Tras la unión al receptor, MYD88 oligomeriza y recluta a IRAK1 mediante interacciones con el dominio de muerte. MYD88 se une directamente a IRAK1, acercándolo a IRAK4 para su fosforilación y activación. Las mutaciones oncogénicas L265P de MYD88 crean complejos constitutivos IRAK1/MYD88 que impulsan la supervivencia de los linfocitos B malignos mediante la activación de NF-κB. La interrupción de la interacción IRAK1/MYD88 representa una estrategia terapéutica para los linfomas inducidos por MYD88.
El AlphaLISA SureFire Ultra Human IRAK1 / MyD88 Complex es un inmunoensayo tipo sándwich para la detección cuantitativa del complejo IRAK1 / MyD88 en lisados ​​celulares, utilizando tecnología Alpha.
Formatos:

El kit HV (alto volumen) contiene reactivos para ejecutar 100 pocillos en formato de 96 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 60 μL.
El kit de 500 puntos contiene suficientes reactivos para ejecutar 500 pocillos en formato de 384 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 20 μL.
El kit de 10 000 puntos contiene suficientes reactivos para ejecutar 10 000 pocillos en formato de 384 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 20 μL.
El kit de 50.000 puntos contiene suficientes reactivos para ejecutar 50.000 pocillos en formato de 384 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 20 μL.

Los kits AlphaLISA SureFire Ultra son compatibles con:

Lisados ​​de células y tejidos
Moduladores de anticuerpos
Anticuerpos bioterapéuticos

Los kits AlphaLISA SureFire Ultra se pueden utilizar para:

Ensayos de quinasas celulares
Estudios de activación de receptores
Cribado de alto rendimiento para estudios preclínicos
Cómo funciona
Principio del ensayo de detección de complejos proteicos AlphaLISA SureFire Ultra
El ensayo complejo AlphaLISA SureFire Ultra mide las interacciones proteína-proteína celulares (PPI).
El ensayo utiliza dos anticuerpos que reconocen la proteína 1 y la proteína 2, respectivamente. Los ensayos AlphaLISA requieren dos tipos de microesferas: aceptoras y donantes. Las microesferas aceptoras están recubiertas con un agente patentado CaptSure™ para inmovilizar específicamente el primer anticuerpo del ensayo, marcado con una etiqueta CaptSure. Las microesferas donantes están recubiertas con estreptavidina para capturar el segundo anticuerpo, que está biotinilado. En presencia del complejo proteico, los dos anticuerpos acercan las microesferas donadoras y aceptoras, por lo que el oxígeno singlete transfiere energía para excitar la microesfera aceptora, lo que permite la generación de una señal alfa luminiscente. La cantidad de luz emitida es directamente proporcional a la cantidad de PPI presente en la muestra.

Protocolo de ensayo de dos placas para detección ultracompleja AlphaLISA SureFire
El protocolo de dos placas implica el cultivo y tratamiento de las células en una placa de 96 pocillos antes de la lisis, y la posterior transferencia de los lisados ​​a una placa Optiplate de 384 pocillos antes de añadir los reactivos de detección complejos AlphaLISA SureFire Ultra. Este protocolo permite monitorizar la viabilidad y la confluencia de las células. Además, los lisados ​​de un solo pocillo pueden utilizarse para medir múltiples dianas.

Protocolo de ensayo de una placa para la detección de complejos proteicos AlphaLISA SureFire Ultra
La detección del complejo proteico con reactivos AlphaLISA SureFire Ultra se puede realizar en una sola placa, utilizada para cultivo, tratamiento y lisis. No requiere lavado. Este protocolo, diseñado por HTS, permite la miniaturización, manteniendo la robusta calidad de AlphaLISA SureFire Ultra.
Sensibilidad del ensayo
Sensibilidad del ensayo: dilución del lisado celular
El lisado celular se preparó a partir de células Karpas 299 a una concentración de 2 x 106 células/ml y se estimuló con 10 ng/ml de IL-1b durante 10 minutos en HBSS + BSA al 0,1 %. Las células se lisaron añadiendo tampón de lisis 5X durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación.
El lisado se diluyó en serie en tampón de lisis y los niveles del complejo IRAK1/MyD88 se evaluaron con AlphaLISA SureFire Ultra. Para la detección, se transfirieron 10 µL de lisado a una placa OptiPlate blanca de 384 pocillos, seguidos de 5 µL de mezcla aceptora y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Finalmente, se añadieron 5 µL de mezcla donadora a cada pocillo y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en oscuridad. La placa se leyó en un Envision con la configuración estándar de AlphaLISA.
Se indica el número aproximado de células por punto de datos. La línea punteada representa el fondo del ensayo. El ensayo puede detectar el complejo IRAK1/MyD88 en hasta 500 células por punto de datos.
Aplicación: Señalización celular
Compatible con automatización: Sí
Marca AlphaLISA SureFire Ultra
Modalidad de detección alfa
Tiempo de protocolo: 2 h a temperatura ambiente
Volumen de muestra: 10 µL
Condiciones de envío - Envío en Blue Ice
Objetivo-IRAK1 / MyD88
Clase objetivo: fosfoproteínas
Especie objetivo: humanos
Tecnología-Alfa
Área terapéutica-Inflamación
Tamaño de la unidad: 500 puntos de ensayo