Revvity, ALSU-P4EBP-B50K, kit de detección de fosforilación 4EBP1 (Ser65) humana y de ratón AlphaLISA, 50 000 puntos de ensayo

Descripción general
La proteína 1 de unión al factor de iniciación de la traducción eucariota 4E (4EBP1) es un represor traduccional que regula la síntesis proteica dependiente de cap mediante la unión y el secuestro de eIF4E, lo que impide la formación del complejo de iniciación de la traducción eIF4F. La actividad de 4EBP1 está controlada por la fosforilación mediada por mTORC1, y la hiperfosforilación provoca la liberación de eIF4E y la activación de la traducción. La 4EBP1 hipofosforilada inhibe preferentemente la traducción de ARNm que codifican proteínas oncogénicas, como c-MYC, ciclina D1 y VEGF. La desregulación de 4EBP1 mediante la hiperactivación de la vía mTOR es común en el cáncer, lo que promueve la progresión tumoral y los trastornos metabólicos. Las estrategias terapéuticas dirigidas al eje mTOR-4EBP1 buscan restaurar el control traduccional en el cáncer y las enfermedades metabólicas.
AlphaLISA SureFire Ultra Human and Mouse Phospho-4EBP1 (Ser65) es un inmunoensayo tipo sándwich para la detección cuantitativa de fosfo-4EBP1 (Ser65) en lisados ​​celulares, utilizando tecnología Alpha.
Formatos:

El kit HV (alto volumen) contiene reactivos para ejecutar 100 pocillos en formato de 96 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 60 μL.
El kit de 500 puntos contiene suficientes reactivos para ejecutar 500 pocillos en formato de 384 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 20 μL.
El kit de 10 000 puntos contiene suficientes reactivos para ejecutar 10 000 pocillos en formato de 384 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 20 μL.
El kit de 50.000 puntos contiene suficientes reactivos para ejecutar 50.000 pocillos en formato de 384 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 20 μL.

Los kits AlphaLISA SureFire Ultra son compatibles con:

Lisados ​​de células y tejidos
Moduladores de anticuerpos
Anticuerpos bioterapéuticos

Los kits AlphaLISA SureFire Ultra se pueden utilizar para:

Ensayos de quinasas celulares
Estudios de activación de receptores
Cribado de alto rendimiento para estudios preclínicos
Cómo funciona
Principio del ensayo Phospho-AlphaLISA SureFire Ultra
El ensayo Phospho-AlphaLISA SureFire Ultra mide un objetivo proteico cuando se fosforila en un residuo específico.
El ensayo utiliza dos anticuerpos que reconocen el epítopo fosforilado y un epítopo distal de la proteína diana. Los ensayos AlphaLISA requieren dos tipos de microesferas: aceptoras y donantes. Las microesferas aceptoras están recubiertas con un agente patentado CaptSure™ para inmovilizar específicamente el anticuerpo específico del ensayo, marcado con una etiqueta CaptSure. Las microesferas donantes están recubiertas con estreptavidina para capturar uno de los anticuerpos de detección, que está biotinilado. En presencia de proteína fosforilada, los dos anticuerpos acercan las microesferas donadora y aceptora, por lo que el oxígeno singlete transfiere energía para excitar la microesfera aceptora, lo que permite la generación de una señal alfa luminiscente. La cantidad de emisión de luz es directamente proporcional a la cantidad de fosfoproteína presente en la muestra.

Protocolo de ensayo de dos placas Phospho-AlphaLISA SureFire Ultra
El protocolo de dos placas implica el cultivo y tratamiento de las células en una placa de 96 pocillos antes de la lisis, y la posterior transferencia de los lisados ​​a una placa OptiPlate™ de 384 pocillos antes de añadir los reactivos de detección Phospho-AlphaLISA SureFire Ultra. Este protocolo permite monitorizar la viabilidad y la confluencia celular. Además, los lisados ​​de un solo pocillo pueden utilizarse para medir múltiples dianas.

Protocolo de ensayo de una placa Phospho-AlphaLISA SureFire Ultra
La detección de la proteína diana fosforilada con los reactivos AlphaLISA SureFire Ultra se puede realizar en una sola placa, utilizada para cultivo, tratamiento y lisis. No requiere lavado. Este protocolo, diseñado para HTS, permite la miniaturización manteniendo la calidad de AlphaLISA SureFire Ultra.
Sensibilidad del ensayo
Sensibilidad del ensayo: dilución del lisado celular
El lisado celular se preparó a partir de células MCF7 cultivadas hasta confluencia en matraces T175, tratadas con 500 µg/mL de insulina durante 30 minutos y lisadas en 20 mL de tampón de lisis durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación.
El lisado se diluyó en serie en tampón de lisis y los niveles de fosfo (Ser65) 4E-BP1 se evaluaron con AlphaLISA SureFire Ultra. Para la detección, se transfirieron 10 µL de lisado a una placa OptiPlate blanca de 384 pocillos, seguidos de 5 µL de mezcla aceptora y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Finalmente, se añadieron 5 µL de mezcla donadora a cada pocillo y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en oscuridad. La placa se leyó en un Envision con la configuración estándar de AlphaLISA.
Se indica el número aproximado de células por punto de datos. La línea punteada representa el fondo del ensayo. El ensayo puede detectar fosfo (Ser65) 4E-BP1 hasta 30 células por punto de datos.
Aplicación: Señalización celular
Compatible con automatización: Sí
Marca AlphaLISA SureFire Ultra
Modalidad de detección alfa
Tiempo de protocolo: 2 h a temperatura ambiente
Volumen de muestra: 10 µL
Condiciones de envío - Envío en Blue Ice
Objetivo-4EBP1
Clase objetivo: fosfoproteínas
Especie objetivo: ratón humano
Tecnología-Alfa
Área Terapéutica-Oncología
Tamaño de la unidad: 50 000 puntos de ensayo