Revvity, ALSU-PATR-A-HV, kit de detección de fosforilación humana AlphaLISA (Thr1989), 100 puntos de ensayo

Descripción general
La Ataxia Telangiectasia y la proteína relacionada con Rad3 (ATR) son serina/treonina quinasas que actúan como regulador principal de la respuesta al daño del ADN, particularmente en respuesta al estrés replicativo. La ATR se activa mediante ADN monocatenario recubierto de RPA, lo que conduce a la fosforilación de efectores posteriores, como CHK1, p53 y H2AX. Tras su activación, la ATR inicia los puntos de control del ciclo celular, estabiliza las horquillas de replicación bloqueadas y promueve la reparación del ADN. Las mutaciones hipomórficas en la ATR causan el síndrome de Seckel, mientras que las células cancerosas a menudo se vuelven dependientes de la ATR para su supervivencia debido al elevado estrés replicativo. Se están desarrollando inhibidores de la ATR como terapias contra el cáncer, mostrando letalidad sintética con pérdida de ATM o mutaciones de BRCA.
AlphaLISA SureFire Ultra Human Phospho-ATR (Thr1989) es un inmunoensayo tipo sándwich para la detección cuantitativa de fosfo-ATR (Thr1989) en lisados ​​celulares, utilizando tecnología Alpha.
Formatos:

El kit HV (alto volumen) contiene reactivos para ejecutar 100 pocillos en formato de 96 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 60 μL.
El kit de 500 puntos contiene suficientes reactivos para ejecutar 500 pocillos en formato de 384 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 20 μL.
El kit de 10 000 puntos contiene suficientes reactivos para ejecutar 10 000 pocillos en formato de 384 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 20 μL.
El kit de 50.000 puntos contiene suficientes reactivos para ejecutar 50.000 pocillos en formato de 384 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 20 μL.

Los kits AlphaLISA SureFire Ultra son compatibles con:

Lisados ​​de células y tejidos
Moduladores de anticuerpos
Anticuerpos bioterapéuticos

Los kits AlphaLISA SureFire Ultra se pueden utilizar para:

Ensayos de quinasas celulares
Estudios de activación de receptores
Cribado de alto rendimiento para estudios preclínicos
Cómo funciona
Principio del ensayo Phospho-AlphaLISA SureFire Ultra
El ensayo Phospho-AlphaLISA SureFire Ultra mide un objetivo proteico cuando se fosforila en un residuo específico.
El ensayo utiliza dos anticuerpos que reconocen el epítopo fosforilado y un epítopo distal de la proteína diana. Los ensayos AlphaLISA requieren dos tipos de microesferas: aceptoras y donantes. Las microesferas aceptoras están recubiertas con un agente patentado CaptSure™ para inmovilizar específicamente el anticuerpo específico del ensayo, marcado con una etiqueta CaptSure. Las microesferas donantes están recubiertas con estreptavidina para capturar uno de los anticuerpos de detección, que está biotinilado. En presencia de proteína fosforilada, los dos anticuerpos acercan las microesferas donadora y aceptora, por lo que el oxígeno singlete transfiere energía para excitar la microesfera aceptora, lo que permite la generación de una señal alfa luminiscente. La cantidad de emisión de luz es directamente proporcional a la cantidad de fosfoproteína presente en la muestra.

Protocolo de ensayo de dos placas Phospho-AlphaLISA SureFire Ultra
El protocolo de dos placas implica el cultivo y tratamiento de las células en una placa de 96 pocillos antes de la lisis, y la posterior transferencia de los lisados ​​a una placa OptiPlate™ de 384 pocillos antes de añadir los reactivos de detección Phospho-AlphaLISA SureFire Ultra. Este protocolo permite monitorizar la viabilidad y la confluencia celular. Además, los lisados ​​de un solo pocillo pueden utilizarse para medir múltiples dianas.

Protocolo de ensayo de una placa Phospho-AlphaLISA SureFire Ultra
La detección de la proteína diana fosforilada con los reactivos AlphaLISA SureFire Ultra se puede realizar en una sola placa, utilizada para cultivo, tratamiento y lisis. No requiere lavado. Este protocolo, diseñado para HTS, permite la miniaturización manteniendo la calidad de AlphaLISA SureFire Ultra.
Sensibilidad del ensayo
Sensibilidad del ensayo ATR: dilución del lisado celular
El lisado celular se preparó a partir de células HeLa cultivadas hasta confluencia en matraces T175 a 37 °C y 5 % de CO₂. Cada matraz se trató con etopósido a 2 µM durante 18 horas y se lisó en 3 ml de tampón de lisis durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación.
El lisado se diluyó en serie en tampón de lisis y ATR fosfo (Thr1989) y los niveles totales se evaluaron con AlphaLISA SureFire Ultra. Para la detección, se transfirieron 10 µL de lisado celular a una placa OptiPlate blanca de 384 pocillos, seguido de 5 µL de mezcla aceptora y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Finalmente, se añadieron 5 µL de mezcla donadora a cada pocillo y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente en oscuridad. La placa se leyó en un Envision con la configuración estándar de AlphaLISA.
Se indica el número aproximado de células por punto de datos. La línea punteada representa el fondo del ensayo. Este ensayo puede detectar fosfo (Thr1989) en menos de 1000 células por punto de datos.
Aplicación: Señalización celular
Compatible con automatización: Sí
Marca AlphaLISA SureFire Ultra
Modalidad de detección alfa
Tiempo de protocolo: 2 h a temperatura ambiente
Volumen de muestra: 30 µL
Condiciones de envío - Envío en Blue Ice
Objetivo-ATR
Clase objetivo: fosfoproteínas
Especie objetivo: humanos
Tecnología-Alfa
Área Terapéutica-Oncología
Tamaño de la unidad: 100 puntos de ensayo