Revvity, ALSU-PBCKD-A-HV, kit de detección de fosforilación humana AlphaLISA BCKDHA (Ser292), 100 puntos de ensayo

Descripción general
La cetoácido deshidrogenasa de cadena ramificada E1-alfa (BCKDHA) es la subunidad catalítica del complejo BCKDC, que cataliza la descarboxilación irreversible de los cetoácidos de cadena ramificada derivados de la leucina, la isoleucina y la valina. La BCKDHA representa el paso limitante en el catabolismo de los aminoácidos de cadena ramificada y se expresa predominantemente en hígado, músculo, riñón y cerebro. Las mutaciones en la BCKDHA causan la enfermedad de la orina con olor a jarabe de arce (MSUD), caracterizada por la acumulación de derivados tóxicos de los cetoácidos que provoca daño neurológico. La gravedad de la MSUD varía según la actividad enzimática residual, desde formas graves clásicas hasta variantes intermedias. La expresión alterada de BCKDHA se ha relacionado con el metabolismo del cáncer, la diabetes y las enfermedades cardiovasculares.
AlphaLISA SureFire Ultra Human Phospho-BCKDHA (Ser292) es un inmunoensayo tipo sándwich para la detección cuantitativa de fosfo-BCKDHA (Ser292) en lisados ​​celulares, utilizando tecnología Alpha.
Formatos:

El kit HV (alto volumen) contiene reactivos para ejecutar 100 pocillos en formato de 96 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 60 μL.
El kit de 500 puntos contiene suficientes reactivos para ejecutar 500 pocillos en formato de 384 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 20 μL.
El kit de 10 000 puntos contiene suficientes reactivos para ejecutar 10 000 pocillos en formato de 384 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 20 μL.
El kit de 50.000 puntos contiene suficientes reactivos para ejecutar 50.000 pocillos en formato de 384 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 20 μL.

Los kits AlphaLISA SureFire Ultra son compatibles con:

Lisados ​​de células y tejidos
Moduladores de anticuerpos
Anticuerpos bioterapéuticos

Los kits AlphaLISA SureFire Ultra se pueden utilizar para:

Ensayos de quinasas celulares
Estudios de activación de receptores
Cribado de alto rendimiento para estudios preclínicos
Cómo funciona
Principio del ensayo Phospho-AlphaLISA SureFire Ultra
El ensayo Phospho-AlphaLISA SureFire Ultra mide un objetivo proteico cuando se fosforila en un residuo específico.
El ensayo utiliza dos anticuerpos que reconocen el epítopo fosforilado y un epítopo distal de la proteína diana. Los ensayos AlphaLISA requieren dos tipos de microesferas: aceptoras y donantes. Las microesferas aceptoras están recubiertas con un agente patentado CaptSure™ para inmovilizar específicamente el anticuerpo específico del ensayo, marcado con una etiqueta CaptSure. Las microesferas donantes están recubiertas con estreptavidina para capturar uno de los anticuerpos de detección, que está biotinilado. En presencia de proteína fosforilada, los dos anticuerpos acercan las microesferas donadora y aceptora, por lo que el oxígeno singlete transfiere energía para excitar la microesfera aceptora, lo que permite la generación de una señal alfa luminiscente. La cantidad de emisión de luz es directamente proporcional a la cantidad de fosfoproteína presente en la muestra.

Protocolo de ensayo de dos placas Phospho-AlphaLISA SureFire Ultra
El protocolo de dos placas implica el cultivo y tratamiento de las células en una placa de 96 pocillos antes de la lisis, y la posterior transferencia de los lisados ​​a una placa OptiPlate™ de 384 pocillos antes de añadir los reactivos de detección Phospho-AlphaLISA SureFire Ultra. Este protocolo permite monitorizar la viabilidad y la confluencia celular. Además, los lisados ​​de un solo pocillo pueden utilizarse para medir múltiples dianas.

Protocolo de ensayo de una placa Phospho-AlphaLISA SureFire Ultra
La detección de la proteína diana fosforilada con los reactivos AlphaLISA SureFire Ultra se puede realizar en una sola placa, utilizada para cultivo, tratamiento y lisis. No requiere lavado. Este protocolo, diseñado para HTS, permite la miniaturización manteniendo la calidad de AlphaLISA SureFire Ultra.
Sensibilidad del ensayo
Sensibilidad del ensayo BCKDHA: dilución del lisado celular
El lisado celular se preparó a partir de células HeLa cultivadas hasta la confluencia en un matraz T175 y se lizaron en 4 ml de tampón de lisis.
El lisado se diluyó en serie en tampón de lisis y fosfo de BCKDHA (Ser292), y los niveles totales se evaluaron con AlphaLISA SureFire Ultra. Para la detección, se transfirieron 10 µL de lisado celular a una placa OptiPlate blanca de 384 pocillos, seguido de 5 µL de mezcla aceptora y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Finalmente, se añadieron 5 µL de mezcla donadora a cada pocillo y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente en oscuridad. La placa se leyó en un Envision con la configuración estándar de AlphaLISA.
Se indica el número aproximado de células. La línea punteada representa el fondo del ensayo. El ensayo BCKDHA tiene un amplio rango dinámico y puede detectar fosforilación (Ser292) BCKDHA en menos de 250 células/punto de datos.
Aplicación: Señalización celular
Compatible con automatización: Sí
Marca AlphaLISA SureFire Ultra
Modalidad de detección alfa
Tiempo de protocolo: 2 h a temperatura ambiente
Volumen de muestra: 30 µL
Condiciones de envío - Envío en Blue Ice
Objetivo-BCKDHA
Clase objetivo: fosfoproteínas
Especie objetivo: humanos
Tecnología-Alfa
Área terapéutica-Neurociencia metabólica oncológica
Tamaño de la unidad: 100 puntos de ensayo