Revvity, ALSU-PPAXIL-A500, kit de detección de fosfopaxilina (Tyr118) humana y de ratón AlphaLISA, 500 puntos de ensayo

Descripción general
La paxilina es una proteína adaptadora de adhesión focal que actúa como plataforma de andamiaje para la integración de señales provenientes de integrinas, receptores de factores de crecimiento y componentes del citoesqueleto. Se localiza en las adherencias focales, donde coordina la adhesión, migración y supervivencia celular mediante interacciones con quinasas (FAK, Src), proteínas estructurales (vinculina, talina) y moléculas de señalización (Crk, p120RasGAP). La paxilina se fosforila en múltiples residuos de tirosina y serina en respuesta a señales de adhesión y crecimiento, modulando sus interacciones proteicas y la señalización posterior. Desempeña un papel crucial en la organización del citoesqueleto, la propagación celular y la migración direccional. La expresión y fosforilación aberrantes de paxilina se asocian con la progresión, invasión y metástasis del cáncer en múltiples tipos de tumores. Dirigir las vías de señalización mediadas por la paxilina representa una posible estrategia para inhibir la motilidad de las células cancerosas y la diseminación metastásica.
AlphaLISA SureFire Ultra Human and Mouse Phospho-Paxillin (Tyr118) es un inmunoensayo tipo sándwich para la detección cuantitativa de fosfo-Paxillin (Tyr118) en lisados ​​celulares, utilizando tecnología Alpha.
Formatos:

El kit HV (alto volumen) contiene reactivos para ejecutar 100 pocillos en formato de 96 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 60 μL.
El kit de 500 puntos contiene suficientes reactivos para ejecutar 500 pocillos en formato de 384 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 20 μL.
El kit de 10 000 puntos contiene suficientes reactivos para ejecutar 10 000 pocillos en formato de 384 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 20 μL.
El kit de 50.000 puntos contiene suficientes reactivos para ejecutar 50.000 pocillos en formato de 384 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 20 μL.

Los kits AlphaLISA SureFire Ultra son compatibles con:

Lisados ​​de células y tejidos
Moduladores de anticuerpos
Anticuerpos bioterapéuticos

Los kits AlphaLISA SureFire Ultra se pueden utilizar para:

Ensayos de quinasas celulares
Estudios de activación de receptores
Cribado de alto rendimiento para estudios preclínicos
Cómo funciona
Principio del ensayo Phospho-AlphaLISA SureFire Ultra
El ensayo Phospho-AlphaLISA SureFire Ultra mide un objetivo proteico cuando se fosforila en un residuo específico.
El ensayo utiliza dos anticuerpos que reconocen el epítopo fosforilado y un epítopo distal de la proteína diana. Los ensayos AlphaLISA requieren dos tipos de microesferas: aceptoras y donantes. Las microesferas aceptoras están recubiertas con un agente patentado CaptSure™ para inmovilizar específicamente el anticuerpo específico del ensayo, marcado con una etiqueta CaptSure. Las microesferas donantes están recubiertas con estreptavidina para capturar uno de los anticuerpos de detección, que está biotinilado. En presencia de proteína fosforilada, los dos anticuerpos acercan las microesferas donadora y aceptora, por lo que el oxígeno singlete transfiere energía para excitar la microesfera aceptora, lo que permite la generación de una señal alfa luminiscente. La cantidad de emisión de luz es directamente proporcional a la cantidad de fosfoproteína presente en la muestra.

Protocolo de ensayo de dos placas Phospho-AlphaLISA SureFire Ultra
El protocolo de dos placas implica el cultivo y tratamiento de las células en una placa de 96 pocillos antes de la lisis, y la posterior transferencia de los lisados ​​a una placa OptiPlate™ de 384 pocillos antes de añadir los reactivos de detección Phospho-AlphaLISA SureFire Ultra. Este protocolo permite monitorizar la viabilidad y la confluencia celular. Además, los lisados ​​de un solo pocillo pueden utilizarse para medir múltiples dianas.

Protocolo de ensayo de una placa Phospho-AlphaLISA SureFire Ultra
La detección de la proteína diana fosforilada con los reactivos AlphaLISA SureFire Ultra se puede realizar en una sola placa, utilizada para cultivo, tratamiento y lisis. No requiere lavado. Este protocolo, diseñado para HTS, permite la miniaturización manteniendo la calidad de AlphaLISA SureFire Ultra.
Versatilidad de ensayos
Niveles basales de fosfopaxilina (Tyr118) en varias líneas celulares
Se sembraron 40.000 células adherentes por pocillo en una placa de cultivo de 96 pocillos en medio completo y se incubaron durante la noche a 37 °C y 5 % de CO₂. Las células se lisaron con 200 µL de tampón de lisis.
Las células en suspensión se sembraron a una concentración de 400.000 células/pocillo en una placa de cultivo de 96 pocillos en HBSS + BSA al 0,1 %. Las células se centrifugaron y se lisaron con 200 µL de tampón de lisis. Los niveles totales de paxilina se evaluaron con AlphaLISA SureFire Ultra. Para la detección, se transfirieron 10 µL de lisado celular (aproximadamente 2.000 células adherentes o 20.000 células en suspensión) a una placa OptiPlate blanca de 384 pocillos, seguido de 5 µL de mezcla aceptora y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Finalmente, se añadieron 5 µL de mezcla donadora a cada pocillo y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente en oscuridad. La placa se leyó en un Envision con la configuración estándar de AlphaLISA.
Como se esperaba, se observaron altos niveles basales de fosfo (Tyr118) Paxillin en las células A431 y C2C12, mientras que se detectaron niveles bajos en las células RT4 y HUVEC.
Aplicación: Señalización celular
Compatible con automatización: Sí
Marca AlphaLISA SureFire Ultra
Modalidad de detección alfa
Tiempo de protocolo: 2 h a temperatura ambiente
Volumen de muestra: 10 µL
Condiciones de envío - Envío en Blue Ice
Objetivo-Paxillin
Clase objetivo: fosfoproteínas
Especie objetivo: ratón humano
Tecnología-Alfa
Área terapéutica-EHNA/Oncología de la fibrosis
Tamaño de la unidad: 500 puntos de ensayo