Revvity, ALSU-PST3-B10K, kit de detección AlphaLISA de alto rendimiento de fosfo-STAT3 (Tyr705) en humanos y ratones, 10 000 puntos de ensayo

Descripción general
El Transductor de Señales y Activador de la Transcripción 3 (STAT3) es un factor de transcripción que media las respuestas celulares a las citocinas y factores de crecimiento, regulando genes implicados en la proliferación, la supervivencia y la respuesta inmunitaria. STAT3 se activa por fosforilación en Tyr705, lo que conduce a la dimerización, la translocación nuclear y la unión al ADN. STAT3 regula la expresión de genes como c-MYC, ciclina D1, BCL-XL y VEGF, promoviendo la progresión del ciclo celular y la supervivencia. La activación constitutiva de STAT3 se encuentra en aproximadamente el 70 % de los tumores, donde impulsa la oncogénesis y crea un microambiente inmunosupresor. Se están desarrollando inhibidores de STAT3 como terapias contra el cáncer para atacar las células tumorales y restaurar la inmunidad antitumoral.
AlphaLISA SureFire Ultra High Performance Human and Mouse Phospho-STAT3 (Tyr705) es un inmunoensayo tipo sándwich para la detección cuantitativa de fosfo-STAT3 (Tyr705) en lisados ​​celulares, utilizando tecnología Alpha.
Formatos:

El kit HV (alto volumen) contiene reactivos para ejecutar 100 pocillos en formato de 96 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 60 μL.
El kit de 500 puntos contiene suficientes reactivos para ejecutar 500 pocillos en formato de 384 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 20 μL.
El kit de 10 000 puntos contiene suficientes reactivos para ejecutar 10 000 pocillos en formato de 384 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 20 μL.
El kit de 50.000 puntos contiene suficientes reactivos para ejecutar 50.000 pocillos en formato de 384 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 20 μL.

Los kits AlphaLISA SureFire Ultra son compatibles con:

Lisados ​​de células y tejidos
Moduladores de anticuerpos
Anticuerpos bioterapéuticos

Los kits AlphaLISA SureFire Ultra se pueden utilizar para:

Ensayos de quinasas celulares
Estudios de activación de receptores
Cribado de alto rendimiento para estudios preclínicos
Cómo funciona
Principio del ensayo Phospho-AlphaLISA SureFire Ultra
El ensayo Phospho-AlphaLISA SureFire Ultra mide un objetivo proteico cuando se fosforila en un residuo específico.
El ensayo utiliza dos anticuerpos que reconocen el epítopo fosforilado y un epítopo distal de la proteína diana. Los ensayos AlphaLISA requieren dos tipos de microesferas: aceptoras y donantes. Las microesferas aceptoras están recubiertas con un agente patentado CaptSure™ para inmovilizar específicamente el anticuerpo específico del ensayo, marcado con una etiqueta CaptSure. Las microesferas donantes están recubiertas con estreptavidina para capturar uno de los anticuerpos de detección, que está biotinilado. En presencia de proteína fosforilada, los dos anticuerpos acercan las microesferas donadora y aceptora, por lo que el oxígeno singlete transfiere energía para excitar la microesfera aceptora, lo que permite la generación de una señal alfa luminiscente. La cantidad de emisión de luz es directamente proporcional a la cantidad de fosfoproteína presente en la muestra.

Protocolo de ensayo de dos placas Phospho-AlphaLISA SureFire Ultra
El protocolo de dos placas implica el cultivo y tratamiento de las células en una placa de 96 pocillos antes de la lisis, y la posterior transferencia de los lisados ​​a una placa OptiPlate™ de 384 pocillos antes de añadir los reactivos de detección Phospho-AlphaLISA SureFire Ultra. Este protocolo permite monitorizar la viabilidad y la confluencia celular. Además, los lisados ​​de un solo pocillo pueden utilizarse para medir múltiples dianas.

Protocolo de ensayo de una placa Phospho-AlphaLISA SureFire Ultra
La detección de la proteína diana fosforilada con los reactivos AlphaLISA SureFire Ultra se puede realizar en una sola placa, utilizada para cultivo, tratamiento y lisis. No requiere lavado. Este protocolo, diseñado para HTS, permite la miniaturización manteniendo la calidad de AlphaLISA SureFire Ultra.
Sensibilidad del ensayo
Sensibilidad del ensayo de alto rendimiento STAT3 p-Y705

Las células THP-1 se sembraron en una placa de 96 pocillos (50.000 células/pocillo) en medio completo con 100 nM de PMA y se incubaron durante 24 horas a 37 °C y 5 % de CO₂. Los macrófagos derivados de THP-1 se mantuvieron en ayunas en HBSS + 0,1 % de BSA durante 2 horas y, posteriormente, se estimularon con concentraciones crecientes de IFNα durante 20 minutos.
Tras el tratamiento, las células se lisaron con 100 µL de tampón de lisis durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación (350 rpm). Los niveles de STAT3 fosfo (Tyr705) y total se evaluaron mediante los respectivos ensayos AlphaLISA SureFire Ultra STAT3. Para la detección, se transfirieron 10 µL de lisado celular (aproximadamente 5000 células) a una placa OptiPlate blanca de 384 pocillos, seguidos de 5 µL de mezcla aceptora y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Finalmente, se añadieron 5 µL de mezcla donadora a cada pocillo y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en oscuridad. La placa se leyó en un analizador Envision con la configuración estándar de AlphaLISA.

El lisado celular se preparó a partir de células A431 cultivadas hasta confluencia en un matraz T175, tratadas con 2 µg/mL de EGF durante 10 minutos y lisadas en 10 mL de tampón de lisis durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación.
El lisado se diluyó en serie en tampón de lisis y STAT3 fosfo (Tyr705). Los niveles totales se evaluaron mediante los respectivos ensayos AlphaLISA SureFire Ultra High Performance STAT3. Para la detección, se transfirieron 10 µL de lisado celular a una placa OptiPlate blanca de 384 pocillos, seguidos de 5 µL de mezcla aceptora y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Finalmente, se añadieron 5 µL de mezcla donadora a cada pocillo y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en oscuridad. La placa se leyó en un Envision con la configuración estándar de AlphaLISA.
Se indica el número aproximado de células. La línea punteada representa el fondo del ensayo. Los ensayos STAT3 de alto rendimiento tienen un amplio rango dinámico y pueden detectar la expresión de STAT3 en menos de 50 células/punto de datos.
Aplicación: Señalización celular
Compatible con automatización: Sí
Marca AlphaLISA SureFire Ultra
Modalidad de detección alfa
Tiempo de protocolo: 2 h a temperatura ambiente
Volumen de muestra: 10 µL
Condiciones de envío - Envío en Blue Ice
Objetivo-STAT3
Clase objetivo: fosfoproteínas
Especie objetivo: ratón humano
Tecnología-Alfa
Área terapéutica-Neurociencia de la inflamación Oncología
Tamaño de la unidad: 10 000 puntos de ensayo