Revvity, ALSU-TAKT3-A10K, kit AlphaLISA de detección de AKT3 total en humanos y ratones, 10 000 puntos de ensayo

Descripción general
AKT3 es una proteína quinasa de serina/treonina y un miembro clave de la vía de señalización PI3K/AKT, desempeñando un papel crucial en el desarrollo cerebral, la supervivencia neuronal y la regulación del crecimiento celular. AKT3 se activa mediante la fosforilación en Thr305 y Ser472, secuencia abajo de PI3K, lo que promueve la síntesis de proteínas, la supervivencia celular y el metabolismo de la glucosa, a la vez que regula el tamaño y la proliferación celular. Es particularmente importante en el sistema nervioso central, donde controla el tamaño cerebral, la diferenciación neuronal y la plasticidad sináptica. Las mutaciones o la expresión alterada de AKT3 se asocian con microcefalia, macrocefalia, trastornos neurológicos y diversos tipos de cáncer, como el melanoma y los carcinomas de mama y próstata. En oncología, AKT3 promueve la supervivencia de las células tumorales, la invasión y la resistencia a fármacos, a la vez que favorece el mantenimiento de las células madre cancerosas y la transición epitelial-mesenquimal. La focalización terapéutica de AKT3 mediante inhibidores selectivos representa una estrategia prometedora tanto para los trastornos del neurodesarrollo como para los subtipos de cáncer agresivos, en particular aquellos con mayor potencial metastásico.
AlphaLISA SureFire Ultra Human and Mouse Total AKT3 es un inmunoensayo tipo sándwich para la detección cuantitativa de AKT3 total en lisados ​​celulares, utilizando tecnología Alpha.
Formatos:

El kit HV (alto volumen) contiene reactivos para ejecutar 100 pocillos en formato de 96 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 60 μL.
El kit de 500 puntos contiene suficientes reactivos para ejecutar 500 pocillos en formato de 384 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 20 μL.
El kit de 10 000 puntos contiene suficientes reactivos para ejecutar 10 000 pocillos en formato de 384 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 20 μL.
El kit de 50.000 puntos contiene suficientes reactivos para ejecutar 50.000 pocillos en formato de 384 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 20 μL.

Los kits AlphaLISA SureFire Ultra son compatibles con:

Lisados ​​de células y tejidos
Moduladores de anticuerpos
Anticuerpos bioterapéuticos

Los kits AlphaLISA SureFire Ultra se pueden utilizar para:

Ensayos de quinasas celulares
Estudios de activación de receptores
Cribado de alto rendimiento para estudios preclínicos
Cómo funciona
Principio del ensayo Total-AlphaLISA SureFire Ultra
El ensayo Total-AlphaLISA SureFire Ultra mide el nivel de expresión de una proteína objetivo en un lisado celular.
El ensayo Total-AlphaLISA SureFire Ultra utiliza dos anticuerpos que reconocen dos epítopos distales diferentes en la proteína diana. Los ensayos AlphaLISA requieren dos tipos de microesferas: aceptoras y donantes. Las microesferas aceptoras están recubiertas con un agente patentado CaptSure™ para inmovilizar específicamente el anticuerpo específico del ensayo, marcado con una etiqueta CaptSure. Las microesferas donantes están recubiertas con estreptavidina para capturar uno de los anticuerpos de detección, que está biotinilado. En presencia de la proteína diana, los dos anticuerpos acercan las microesferas donadoras y aceptoras, por lo que el oxígeno singlete transfiere energía para excitar la microesfera aceptora, lo que permite la generación de una señal alfa luminiscente. La cantidad de luz emitida es directamente proporcional a la cantidad de proteína presente en la muestra.

Protocolo de ensayo de dos placas Total-AlphaLISA SureFire Ultra
El protocolo de dos placas implica el cultivo y tratamiento de las células en una placa de 96 pocillos antes de la lisis, y la posterior transferencia de los lisados ​​a una placa OptiPlate™ de 384 pocillos antes de añadir los reactivos de detección Total-AlphaLISA SureFire Ultra. Este protocolo permite monitorizar la viabilidad y la confluencia celular. Además, los lisados ​​de un solo pocillo pueden utilizarse para medir múltiples dianas.

Protocolo de ensayo de una placa Total-AlphaLISA SureFire Ultra
La detección de la proteína diana total con los reactivos AlphaLISA SureFire Ultra se puede realizar en una sola placa, utilizada para cultivo, tratamiento y lisis. No requiere lavado. Este protocolo, diseñado por HTS, permite la miniaturización manteniendo la calidad de AlphaLISA SureFire Ultra.
Versatilidad de ensayos
Expresión de AKT3 en varias líneas celulares

Las líneas celulares adherentes se sembraron en una placa de 96 pocillos (40.000 células/pocillo) y se incubaron durante la noche a 37 °C y 5 % de CO₂. Las células se lisaron con 100 µL de tampón de lisis durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación (350 rpm).
Las líneas celulares en suspensión se sembraron en una placa de 96 pocillos (400 000 células/pocillo) en HBSS + 0,1 % de BSA y luego se lisaron con 100 µL de tampón de lisis durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación (350 rpm).
Los niveles totales de AKT3 se evaluaron con AlphaLISA SureFire Ultra. Para la detección, se transfirieron 10 µL de lisado celular (aproximadamente 4000 células adherentes o 40 000 células en suspensión) a una placa OptiPlate blanca de 384 pocillos, seguido de 5 µL de mezcla aceptora y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Finalmente, se añadieron 5 µL de mezcla donante a cada pocillo y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente en oscuridad. La placa se leyó en un Envision con la configuración estándar de AlphaLISA.
Aplicación: Señalización celular
Compatible con automatización: Sí
Marca AlphaLISA SureFire Ultra
Modalidad de detección alfa
Tiempo de protocolo: 2 h a temperatura ambiente
Volumen de muestra: 10 µL
Condiciones de envío - Envío en Blue Ice
Objetivo-AKT3
Clase objetivo: fosfoproteínas
Especie objetivo: ratón humano
Tecnología-Alfa
Área Terapéutica-Oncología
Tamaño de la unidad: 10 000 puntos de ensayo