Revvity, ALSU-TBRAF-B10K, kit de detección AlphaLISA Human Total B-Raf V600E, 10 000 puntos de ensayo

Descripción general
B-Raf es una proteína quinasa de serina/treonina, miembro de la familia RAF, que funciona como un componente crucial de la cascada de señalización RAS-RAF-MEK-ERK. B-Raf se activa mediante la unión de RAS-GTP, lo que promueve la dimerización y la activación de la quinasa, lo que conduce a la fosforilación de MEK1/2. La mutación V600E en B-Raf, presente en aproximadamente el 50 % de los melanomas, produce actividad quinasa constitutiva y transformación oncogénica. Otras mutaciones de B-Raf pueden, paradójicamente, activar la RAF de tipo silvestre mediante una dimerización mejorada. Los inhibidores específicos de B-Raf, como vemurafenib y dabrafenib, han revolucionado el tratamiento del melanoma con la mutación V600E de B-Raf.
AlphaLISA SureFire Ultra Human Total B-Raf V600E es un inmunoensayo tipo sándwich para la detección cuantitativa de B-Raf V600E total en lisados ​​celulares, utilizando tecnología Alpha.
Formatos:

El kit HV (alto volumen) contiene reactivos para ejecutar 100 pocillos en formato de 96 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 60 μL.
El kit de 500 puntos contiene suficientes reactivos para ejecutar 500 pocillos en formato de 384 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 20 μL.
El kit de 10 000 puntos contiene suficientes reactivos para ejecutar 10 000 pocillos en formato de 384 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 20 μL.
El kit de 50.000 puntos contiene suficientes reactivos para ejecutar 50.000 pocillos en formato de 384 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 20 μL.

Los kits AlphaLISA SureFire Ultra son compatibles con:

Lisados ​​de células y tejidos
Moduladores de anticuerpos
Anticuerpos bioterapéuticos

Los kits AlphaLISA SureFire Ultra se pueden utilizar para:

Ensayos de quinasas celulares
Estudios de activación de receptores
Cribado de alto rendimiento para estudios preclínicos
Cómo funciona
Principio del ensayo Total-AlphaLISA SureFire Ultra
El ensayo Total-AlphaLISA SureFire Ultra mide el nivel de expresión de una proteína objetivo en un lisado celular.
El ensayo Total-AlphaLISA SureFire Ultra utiliza dos anticuerpos que reconocen dos epítopos distales diferentes en la proteína diana. Los ensayos AlphaLISA requieren dos tipos de microesferas: aceptoras y donantes. Las microesferas aceptoras están recubiertas con un agente patentado CaptSure™ para inmovilizar específicamente el anticuerpo específico del ensayo, marcado con una etiqueta CaptSure. Las microesferas donantes están recubiertas con estreptavidina para capturar uno de los anticuerpos de detección, que está biotinilado. En presencia de la proteína diana, los dos anticuerpos acercan las microesferas donadoras y aceptoras, por lo que el oxígeno singlete transfiere energía para excitar la microesfera aceptora, lo que permite la generación de una señal alfa luminiscente. La cantidad de luz emitida es directamente proporcional a la cantidad de proteína presente en la muestra.

Protocolo de ensayo de dos placas Total-AlphaLISA SureFire Ultra
El protocolo de dos placas implica el cultivo y tratamiento de las células en una placa de 96 pocillos antes de la lisis, y la posterior transferencia de los lisados ​​a una placa OptiPlate™ de 384 pocillos antes de añadir los reactivos de detección Total-AlphaLISA SureFire Ultra. Este protocolo permite monitorizar la viabilidad y la confluencia celular. Además, los lisados ​​de un solo pocillo pueden utilizarse para medir múltiples dianas.

Protocolo de ensayo de una placa Total-AlphaLISA SureFire Ultra
La detección de la proteína diana total con los reactivos AlphaLISA SureFire Ultra se puede realizar en una sola placa, utilizada para cultivo, tratamiento y lisis. No requiere lavado. Este protocolo, diseñado por HTS, permite la miniaturización manteniendo la calidad de AlphaLISA SureFire Ultra.
Versatilidad de ensayos
Expresión diferencial de mutantes B-Raf frente a tipo salvaje
Las células adherentes se cultivaron hasta la confluencia en matraces T175 a 37 °C, 5 % de CO2 y se lisaron con tampón de lisis a una densidad de 0,5 x 106 células/ml.
Los niveles de B-Raf V600E y B-Raf Total se evaluaron mediante los respectivos ensayos AlphaLISA SureFire Ultra. Para la detección, se transfirieron 10 µL de lisado celular a una placa OptiPlate blanca de 384 pocillos, seguidos de 5 µL de mezcla aceptora y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Finalmente, se añadieron 5 µL de mezcla donante a cada pocillo y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en oscuridad. La placa se leyó en un Envision con la configuración estándar de AlphaLISA.
La B-Raf V600E solo se detecta en líneas celulares cancerosas que presentan esta mutación, es decir, las células A375, SK-MEL-28 y HT 29. Como era de esperar, no se detectó expresión de B-Raf V600E en líneas celulares que expresan B-Raf WT, como SW 48.
Sensibilidad del ensayo
Sensibilidad del ensayo: lisado celular
El lisado celular se preparó a partir de A375 cultivado hasta confluencia en un matraz T175 y se lisó en 6 ml de tampón de lisis.
El lisado se diluyó en serie en tampón de lisis y se evaluaron los niveles de B-Raf V600E con el kit AlphaLISA SureFire Ultra. Para la detección, se transfirieron 10 µL de lisado a una placa OptiPlate blanca de 384 pocillos, seguido de 5 µL de mezcla aceptora y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente en oscuridad. La placa se leyó en un Envision con la configuración estándar de AlphaLISA.
El número aproximado de células por punto de datos se indica en el gráfico. La línea punteada representa el fondo del ensayo. El ensayo puede detectar B-Raf B600E en un número de aproximadamente 400 células.
Aplicación: Señalización celular
Compatible con automatización: Sí
Marca AlphaLISA SureFire Ultra
Modalidad de detección alfa
Tiempo de protocolo: 2 h a temperatura ambiente
Volumen de muestra: 10 µL
Condiciones de envío - Envío en Blue Ice
Objetivo-B-Raf
Clase objetivo: fosfoproteínas
Especie objetivo: humanos
Tecnología-Alfa
Área Terapéutica-Oncología
Tamaño de la unidad: 10 000 puntos de ensayo