Revvity, ALSU-THIF-A-HV, AlphaLISA Human Total HIF2α Detection Kit, 100 puntos de ensayo

Descripción general
El factor inducible por hipoxia 2-alfa (HIF2α) es un factor de transcripción sensible al oxígeno que regula la adaptación celular a la hipoxia mediante el control de genes implicados en la angiogénesis, la eritropoyesis y el metabolismo. En condiciones de normoxia, HIF2α es hidroxilado por prolil hidroxilasas, lo que provoca su degradación mediada por VHL. Durante la hipoxia, HIF2α se estabiliza y heterodimeriza con HIF1β para unirse a elementos de respuesta a la hipoxia en promotores de genes diana. HIF2α regula de forma única la eritropoyetina, el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) en células endoteliales y genes implicados en el metabolismo lipídico. Las mutaciones en VHL o HIF2α causan policitemia y carcinoma renal de células claras, donde la actividad constitutiva de HIF2α impulsa el crecimiento tumoral. Los inhibidores específicos de HIF2α, como el belzutifan, han demostrado una eficacia notable en el CCRcc.
AlphaLISA SureFire Ultra Human Total HIF2α es un inmunoensayo tipo sándwich para la detección cuantitativa de HIF2α total en lisados ​​celulares, utilizando tecnología Alpha.
Formatos:

El kit HV (alto volumen) contiene reactivos para ejecutar 100 pocillos en formato de 96 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 60 μL.
El kit de 500 puntos contiene suficientes reactivos para ejecutar 500 pocillos en formato de 384 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 20 μL.
El kit de 10 000 puntos contiene suficientes reactivos para ejecutar 10 000 pocillos en formato de 384 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 20 μL.
El kit de 50.000 puntos contiene suficientes reactivos para ejecutar 50.000 pocillos en formato de 384 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 20 μL.

Los kits AlphaLISA SureFire Ultra son compatibles con:

Lisados ​​de células y tejidos
Moduladores de anticuerpos
Anticuerpos bioterapéuticos

Los kits AlphaLISA SureFire Ultra se pueden utilizar para:

Ensayos de quinasas celulares
Estudios de activación de receptores
Cribado de alto rendimiento para estudios preclínicos
Cómo funciona
Principio del ensayo Total-AlphaLISA SureFire Ultra
El ensayo Total-AlphaLISA SureFire Ultra mide el nivel de expresión de una proteína objetivo en un lisado celular.
El ensayo Total-AlphaLISA SureFire Ultra utiliza dos anticuerpos que reconocen dos epítopos distales diferentes en la proteína diana. Los ensayos AlphaLISA requieren dos tipos de microesferas: aceptoras y donantes. Las microesferas aceptoras están recubiertas con un agente patentado CaptSure™ para inmovilizar específicamente el anticuerpo específico del ensayo, marcado con una etiqueta CaptSure. Las microesferas donantes están recubiertas con estreptavidina para capturar uno de los anticuerpos de detección, que está biotinilado. En presencia de la proteína diana, los dos anticuerpos acercan las microesferas donadoras y aceptoras, por lo que el oxígeno singlete transfiere energía para excitar la microesfera aceptora, lo que permite la generación de una señal alfa luminiscente. La cantidad de luz emitida es directamente proporcional a la cantidad de proteína presente en la muestra.

Protocolo de ensayo de dos placas Total-AlphaLISA SureFire Ultra
El protocolo de dos placas implica el cultivo y tratamiento de las células en una placa de 96 pocillos antes de la lisis, y la posterior transferencia de los lisados ​​a una placa OptiPlate™ de 384 pocillos antes de añadir los reactivos de detección Total-AlphaLISA SureFire Ultra. Este protocolo permite monitorizar la viabilidad y la confluencia celular. Además, los lisados ​​de un solo pocillo pueden utilizarse para medir múltiples dianas.

Protocolo de ensayo de una placa Total-AlphaLISA SureFire Ultra
La detección de la proteína diana total con los reactivos AlphaLISA SureFire Ultra se puede realizar en una sola placa, utilizada para cultivo, tratamiento y lisis. No requiere lavado. Este protocolo, diseñado por HTS, permite la miniaturización manteniendo la calidad de AlphaLISA SureFire Ultra.
Versatilidad de ensayos
Expresión de HIF-2α en varias líneas celulares
Las células adherentes se sembraron a una concentración de 40.000 células/pocillo en una placa de cultivo de 96 pocillos en medio completo y se incubaron durante la noche a 37 °C y 5 % de CO₂. Las células se trataron con CoCl₂ durante 4 horas, se lavaron con HBSS y se lisaron con 100 µL de tampón de lisis.
Los niveles totales de HIF-2α se evaluaron con AlphaLISA SureFire Ultra. Para la detección, se transfirieron 10 µL de lisado celular (aproximadamente 4000 células) a una placa OptiPlate blanca de 384 pocillos, seguidos de 5 µL de mezcla aceptora y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Finalmente, se añadieron 5 µL de mezcla donadora a cada pocillo y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en oscuridad. La placa se leyó en un Envision con la configuración estándar de AlphaLISA.
Sensibilidad del ensayo
Sensibilidad del ensayo: lisado celular
El lisado celular se preparó a partir de células HEK293 cultivadas hasta confluencia en un matraz T175 y estimuladas con 250 µM de CoCl₂ durante 18 horas. Las células se lisaron con tampón de lisis durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación.
El lisado se diluyó en serie en tampón de lisis y los niveles totales de HIF-2α se evaluaron con AlphaLISA SureFire Ultra. Para la detección, se transfirieron 10 µL de lisado a una placa OptiPlate blanca de 384 pocillos, seguidos de 5 µL de mezcla aceptora y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Finalmente, se añadieron 5 µL de mezcla donadora a cada pocillo y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en oscuridad. La placa se leyó en un Envision con la configuración estándar de AlphaLISA.
Se indica el número aproximado de células por punto de datos. La línea punteada representa el fondo del ensayo. El ensayo puede detectar HIF-2α total hasta 500 células por punto de datos.
Aplicación: Señalización celular
Compatible con automatización: Sí
Marca AlphaLISA SureFire Ultra
Modalidad de detección alfa
Tiempo de protocolo: 2 h a temperatura ambiente
Volumen de muestra: 30 µL
Condiciones de envío - Envío en Blue Ice
Objetivo-HIF2α
Clase objetivo: fosfoproteínas
Especie objetivo: humanos
Tecnología-Alfa
Área terapéutica-Inflamación
Tamaño de la unidad: 100 puntos de ensayo