Revvity, ALSU-TIRAK1-A50K, kit de detección AlphaLISA Human Total IRAK1, 50 000 puntos de ensayo

Descripción general
La quinasa 1 asociada al receptor de interleucina-1 (IRAK1) es una serina/treonina quinasa que media la transducción de señales aguas abajo de los TLR y los IL-1R para activar la respuesta inmunitaria innata. IRAK1 se recluta al complejo de señalización MYD88, donde experimenta fosforilación y autofosforilación mediadas por IRAK4. La IRAK1 activada fosforila y recluta a TRAF6, iniciando cascadas de señalización que activan las vías NF-κB y MAPK. La actividad desregulada de IRAK1 contribuye a enfermedades autoinflamatorias, sepsis y cáncer. Se están desarrollando inhibidores selectivos de IRAK1 como terapias para enfermedades inflamatorias y neoplasias malignas inducidas por MYD88.
AlphaLISA SureFire Ultra Human Total IRAK1 es un inmunoensayo tipo sándwich para la detección cuantitativa de IRAK1 total en lisados ​​celulares, utilizando tecnología Alpha.
Formatos:

El kit HV (alto volumen) contiene reactivos para ejecutar 100 pocillos en formato de 96 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 60 μL.
El kit de 500 puntos contiene suficientes reactivos para ejecutar 500 pocillos en formato de 384 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 20 μL.
El kit de 10 000 puntos contiene suficientes reactivos para ejecutar 10 000 pocillos en formato de 384 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 20 μL.
El kit de 50.000 puntos contiene suficientes reactivos para ejecutar 50.000 pocillos en formato de 384 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 20 μL.

Los kits AlphaLISA SureFire Ultra son compatibles con:

Lisados ​​de células y tejidos
Moduladores de anticuerpos
Anticuerpos bioterapéuticos

Los kits AlphaLISA SureFire Ultra se pueden utilizar para:

Ensayos de quinasas celulares
Estudios de activación de receptores
Cribado de alto rendimiento para estudios preclínicos
Cómo funciona
Principio del ensayo Total-AlphaLISA SureFire Ultra
El ensayo Total-AlphaLISA SureFire Ultra mide el nivel de expresión de una proteína objetivo en un lisado celular.
El ensayo Total-AlphaLISA SureFire Ultra utiliza dos anticuerpos que reconocen dos epítopos distales diferentes en la proteína diana. Los ensayos AlphaLISA requieren dos tipos de microesferas: aceptoras y donantes. Las microesferas aceptoras están recubiertas con un agente patentado CaptSure™ para inmovilizar específicamente el anticuerpo específico del ensayo, marcado con una etiqueta CaptSure. Las microesferas donantes están recubiertas con estreptavidina para capturar uno de los anticuerpos de detección, que está biotinilado. En presencia de la proteína diana, los dos anticuerpos acercan las microesferas donadoras y aceptoras, por lo que el oxígeno singlete transfiere energía para excitar la microesfera aceptora, lo que permite la generación de una señal alfa luminiscente. La cantidad de luz emitida es directamente proporcional a la cantidad de proteína presente en la muestra.

Protocolo de ensayo de dos placas Total-AlphaLISA SureFire Ultra
El protocolo de dos placas implica el cultivo y tratamiento de las células en una placa de 96 pocillos antes de la lisis, y la posterior transferencia de los lisados ​​a una placa OptiPlate™ de 384 pocillos antes de añadir los reactivos de detección Total-AlphaLISA SureFire Ultra. Este protocolo permite monitorizar la viabilidad y la confluencia celular. Además, los lisados ​​de un solo pocillo pueden utilizarse para medir múltiples dianas.

Protocolo de ensayo de una placa Total-AlphaLISA SureFire Ultra
La detección de la proteína diana total con los reactivos AlphaLISA SureFire Ultra se puede realizar en una sola placa, utilizada para cultivo, tratamiento y lisis. No requiere lavado. Este protocolo, diseñado por HTS, permite la miniaturización manteniendo la calidad de AlphaLISA SureFire Ultra.
Versatilidad de ensayos
Expresión de IRAK1 en varias líneas celulares
Las líneas celulares adherentes se sembraron en una placa de 96 pocillos (40.000 células/pocillo) y se incubaron durante la noche a 37 °C y 5 % de CO₂. Las células se lisaron con 100 µL de tampón de lisis durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación (350 rpm).
Las líneas celulares en suspensión se sembraron en una placa de 96 pocillos (400 000 células/pocillo) y se lisaron con 100 µL de tampón de lisis durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación (350 rpm).
Los niveles de IRAK1 se evaluaron mediante el ensayo AlphaLISA SureFire Ultra. Para la detección, se transfirieron 10 µL de lisado celular (aproximadamente 4000 células adherentes y 40 000 células en suspensión) a una placa OptiPlate blanca de 384 pocillos, seguido de 5 µL de mezcla aceptora y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Finalmente, se añadieron 5 µL de mezcla donante a cada pocillo y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente en oscuridad. La placa se leyó en un analizador Envision con la configuración estándar de AlphaLISA.
Como era de esperar, la proteína IRAK1 total se expresa en una amplia gama de tipos de células.
Sensibilidad del ensayo
Sensibilidad del ensayo IRAK1 total

La sensibilidad del ensayo IRAK1 total se evaluó analizando la proteína IRAK1 recombinante (ab268680).
Se prepararon diluciones de la proteína IRAK1 recombinante en tampón de lisis y se evaluaron mediante el ensayo AlphaLISA SureFire Ultra. Para la detección, se transfirieron 10 µL de proteína a una placa OptiPlate blanca de 384 pocillos, seguidos de 5 µL de mezcla aceptora y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Finalmente, se añadieron 5 µL de mezcla donadora a cada pocillo y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en oscuridad. La placa se leyó en un Envision con la configuración estándar de AlphaLISA.

El lisado celular se preparó a partir de células HEK293T cultivadas hasta confluencia en un matraz T175 y se lizaron en 4 ml de tampón de lisis durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación.
El lisado se diluyó en serie en tampón de lisis y los niveles totales de IRAK1 se evaluaron con AlphaLISA SureFire Ultra. Para la detección, se transfirieron 10 µL de lisado celular a una placa OptiPlate blanca de 384 pocillos, seguido de 5 µL de mezcla aceptora y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Finalmente, se añadieron 5 µL de mezcla donadora a cada pocillo y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente en oscuridad. La placa se leyó en un Envision con la configuración estándar de AlphaLISA.
Se indica el número aproximado de células por punto de datos. La línea punteada representa el fondo del ensayo. Este ensayo puede detectar la expresión de IRAK1 en menos de 100 células por punto de datos.
Aplicación: Señalización celular
Compatible con automatización: Sí
Marca AlphaLISA SureFire Ultra
Modalidad de detección alfa
Tiempo de protocolo: 2 h a temperatura ambiente
Volumen de muestra: 10 µL
Condiciones de envío - Envío en Blue Ice
Objetivo-IRAK1
Clase objetivo: fosfoproteínas
Especie objetivo: humanos
Tecnología-Alfa
Área terapéutica-Inflamación
Tamaño de la unidad: 50 000 puntos de ensayo