Revvity, ALSU-TIRE1-A500, kit de detección de IRE1α total en humanos y ratones AlphaLISA, 500 puntos de ensayo

Descripción general
La enzima 1 alfa que requiere inositol (IRE1A) es una proteína transmembrana del retículo endoplasmático (RE) que funciona como quinasa y endorribonucleasa en la respuesta a proteínas desplegadas (UPR). Ante el estrés del RE, IRE1A sufre oligomerización y autofosforilación, activando su dominio ARNasa para empalmar el ARNm de XBP1 y generar el factor de transcripción activo XBP1s. XBP1s promueve la expresión de chaperonas del RE, enzimas de síntesis lipídica y componentes de degradación asociados al RE para restablecer la homeostasis del RE. IRE1A también degrada los ARNm localizados en el RE mediante la desintegración regulada dependiente de IRE1 (RIDD) para reducir la carga proteica del RE. La activación crónica de IRE1A contribuye a la inflamación, la apoptosis y la patogénesis de enfermedades como el cáncer, la diabetes y los trastornos neurodegenerativos. La modulación de la actividad de IRE1A representa una oportunidad terapéutica para las enfermedades relacionadas con el estrés del RE.
AlphaLISA SureFire Ultra Human and Mouse Total IRE1α es un inmunoensayo tipo sándwich para la detección cuantitativa de IRE1α total en lisados ​​celulares, utilizando tecnología Alpha.
Formatos:

El kit HV (alto volumen) contiene reactivos para ejecutar 100 pocillos en formato de 96 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 60 μL.
El kit de 500 puntos contiene suficientes reactivos para ejecutar 500 pocillos en formato de 384 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 20 μL.
El kit de 10 000 puntos contiene suficientes reactivos para ejecutar 10 000 pocillos en formato de 384 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 20 μL.
El kit de 50.000 puntos contiene suficientes reactivos para ejecutar 50.000 pocillos en formato de 384 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 20 μL.

Los kits AlphaLISA SureFire Ultra son compatibles con:

Lisados ​​de células y tejidos
Moduladores de anticuerpos
Anticuerpos bioterapéuticos

Los kits AlphaLISA SureFire Ultra se pueden utilizar para:

Ensayos de quinasas celulares
Estudios de activación de receptores
Cribado de alto rendimiento para estudios preclínicos
Cómo funciona
Principio del ensayo Total-AlphaLISA SureFire Ultra
El ensayo Total-AlphaLISA SureFire Ultra mide el nivel de expresión de una proteína objetivo en un lisado celular.
El ensayo Total-AlphaLISA SureFire Ultra utiliza dos anticuerpos que reconocen dos epítopos distales diferentes en la proteína diana. Los ensayos AlphaLISA requieren dos tipos de microesferas: aceptoras y donantes. Las microesferas aceptoras están recubiertas con un agente patentado CaptSure™ para inmovilizar específicamente el anticuerpo específico del ensayo, marcado con una etiqueta CaptSure. Las microesferas donantes están recubiertas con estreptavidina para capturar uno de los anticuerpos de detección, que está biotinilado. En presencia de la proteína diana, los dos anticuerpos acercan las microesferas donadoras y aceptoras, por lo que el oxígeno singlete transfiere energía para excitar la microesfera aceptora, lo que permite la generación de una señal alfa luminiscente. La cantidad de luz emitida es directamente proporcional a la cantidad de proteína presente en la muestra.

Protocolo de ensayo de dos placas Total-AlphaLISA SureFire Ultra
El protocolo de dos placas implica el cultivo y tratamiento de las células en una placa de 96 pocillos antes de la lisis, y la posterior transferencia de los lisados ​​a una placa OptiPlate™ de 384 pocillos antes de añadir los reactivos de detección Total-AlphaLISA SureFire Ultra. Este protocolo permite monitorizar la viabilidad y la confluencia celular. Además, los lisados ​​de un solo pocillo pueden utilizarse para medir múltiples dianas.

Protocolo de ensayo de una placa Total-AlphaLISA SureFire Ultra
La detección de la proteína diana total con los reactivos AlphaLISA SureFire Ultra se puede realizar en una sola placa, utilizada para cultivo, tratamiento y lisis. No requiere lavado. Este protocolo, diseñado por HTS, permite la miniaturización manteniendo la calidad de AlphaLISA SureFire Ultra.
Versatilidad de ensayos
Expresión de IRE1 en varias líneas celulares
Las células adherentes se sembraron a una concentración de 40.000 células/pocillo en una placa de cultivo de 96 pocillos en medio completo y se incubaron durante la noche a 37 °C y 5 % de CO₂. Las células se lisaron con 100 µL de tampón de lisis. Las células en suspensión se lavaron con HBSS y se lisaron con tampón de lisis a una concentración de 4 x 10⁻¹ células/ml.
Los niveles de IRE1 se evaluaron con AlphaLISA SureFire Ultra. Para la detección, se transfirieron 10 µL de lisado celular (4000 células adherentes o 40 000 células en suspensión) a una placa OptiPlate blanca de 384 pocillos, seguido de 5 µL de mezcla aceptora y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Finalmente, se añadieron 5 µL de mezcla donante a cada pocillo y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente en oscuridad. La placa se leyó en un Envision con la configuración estándar de AlphaLISA.
Aplicación: Señalización celular
Compatible con automatización: Sí
Marca AlphaLISA SureFire Ultra
Modalidad de detección alfa
Tiempo de protocolo: 2 h a temperatura ambiente
Volumen de muestra: 10 µL
Condiciones de envío - Envío en Blue Ice
Objetivo-IRE1α
Clase objetivo: fosfoproteínas
Especie objetivo: ratón humano
Tecnología-Alfa
Área terapéutica-Neurociencia metabólica oncológica
Tamaño de la unidad: 500 puntos de ensayo