Revvity, ALSU-TIRF4-A-HV, kit de detección de IRF4 total humano AlphaLISA, 100 puntos de ensayo

Descripción general
El factor regulador del interferón 4 (IRF4) es un factor de transcripción esencial para el desarrollo, la activación y la diferenciación de los linfocitos en linfocitos B, linfocitos T y células dendríticas. IRF4 funciona como activador y represor transcripcional, formando complejos con PU.1, BATF y otros factores de transcripción. En los linfocitos B, IRF4 es crucial para la formación del centro germinal y la diferenciación de las células plasmáticas, mientras que en los linfocitos T controla la diferenciación de linfocitos Th2, Th17 y linfocitos T cooperadores foliculares. La expresión desregulada de IRF4 es un rasgo distintivo del mieloma múltiple y ciertos linfomas, donde promueve la supervivencia de las células plasmáticas. IRF4 es una diana terapéutica atractiva para neoplasias hematológicas y enfermedades autoinmunes.
AlphaLISA SureFire Ultra Human Total IRF4 es un inmunoensayo tipo sándwich para la detección cuantitativa de IRF4 total en lisados ​​celulares, utilizando tecnología Alpha.
Formatos:

El kit HV (alto volumen) contiene reactivos para ejecutar 100 pocillos en formato de 96 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 60 μL.
El kit de 500 puntos contiene suficientes reactivos para ejecutar 500 pocillos en formato de 384 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 20 μL.
El kit de 10 000 puntos contiene suficientes reactivos para ejecutar 10 000 pocillos en formato de 384 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 20 μL.
El kit de 50.000 puntos contiene suficientes reactivos para ejecutar 50.000 pocillos en formato de 384 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 20 μL.

Los kits AlphaLISA SureFire Ultra son compatibles con:

Lisados ​​de células y tejidos
Moduladores de anticuerpos
Anticuerpos bioterapéuticos

Los kits AlphaLISA SureFire Ultra se pueden utilizar para:

Ensayos de quinasas celulares
Estudios de activación de receptores
Cribado de alto rendimiento para estudios preclínicos
Cómo funciona
Principio del ensayo Total-AlphaLISA SureFire Ultra
El ensayo Total-AlphaLISA SureFire Ultra mide el nivel de expresión de una proteína objetivo en un lisado celular.
El ensayo Total-AlphaLISA SureFire Ultra utiliza dos anticuerpos que reconocen dos epítopos distales diferentes en la proteína diana. Los ensayos AlphaLISA requieren dos tipos de microesferas: aceptoras y donantes. Las microesferas aceptoras están recubiertas con un agente patentado CaptSure™ para inmovilizar específicamente el anticuerpo específico del ensayo, marcado con una etiqueta CaptSure. Las microesferas donantes están recubiertas con estreptavidina para capturar uno de los anticuerpos de detección, que está biotinilado. En presencia de la proteína diana, los dos anticuerpos acercan las microesferas donadoras y aceptoras, por lo que el oxígeno singlete transfiere energía para excitar la microesfera aceptora, lo que permite la generación de una señal alfa luminiscente. La cantidad de luz emitida es directamente proporcional a la cantidad de proteína presente en la muestra.

Protocolo de ensayo de dos placas Total-AlphaLISA SureFire Ultra
El protocolo de dos placas implica el cultivo y tratamiento de las células en una placa de 96 pocillos antes de la lisis, y la posterior transferencia de los lisados ​​a una placa OptiPlate™ de 384 pocillos antes de añadir los reactivos de detección Total-AlphaLISA SureFire Ultra. Este protocolo permite monitorizar la viabilidad y la confluencia celular. Además, los lisados ​​de un solo pocillo pueden utilizarse para medir múltiples dianas.

Protocolo de ensayo de una placa Total-AlphaLISA SureFire Ultra
La detección de la proteína diana total con los reactivos AlphaLISA SureFire Ultra se puede realizar en una sola placa, utilizada para cultivo, tratamiento y lisis. No requiere lavado. Este protocolo, diseñado por HTS, permite la miniaturización manteniendo la calidad de AlphaLISA SureFire Ultra.
Versatilidad de ensayos
Expresión diferencial de IRF4 en varias líneas celulares
Las células adherentes se cultivaron hasta confluencia en un matraz T175 a 37 °C y 5 % de CO₂, y se lisaron con tampón de lisis a una densidad de 0,5 x 10⁻ células/ml. Las células en suspensión se recogieron, se lavaron con HBSS y se lisaron con tampón de lisis a una densidad de 1,6 x 10⁻ células/ml.
Los niveles totales de IRF4 se evaluaron mediante el ensayo AlphaLISA SureFire Ultra. Para la detección, se transfirieron 10 µL de lisado celular a una placa OptiPlate blanca de 384 pocillos, seguidos de 5 µL de mezcla aceptora y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Finalmente, se añadieron 5 µL de mezcla donante a cada pocillo y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en oscuridad. La placa se leyó en un Envision con la configuración estándar de AlphaLISA.
Como se esperaba, la proteína IRF4 total está altamente expresada en líneas de células de linfoma B como RPMI 8226 y Karpas299, sin que se detecte expresión en Jurkat o A431.
Sensibilidad del ensayo
Sensibilidad del ensayo: lisado celular
El lisado celular se preparó a partir de células Karpas 299. Las células se recolectaron, se lavaron con HBSS y se lisaron a una densidad de 0,25 x 106 células/ml en tampón de lisis.
Los lisados ​​se diluyeron en serie en tampón de lisis y se analizaron los niveles totales de IRF4 con el kit AlphaLISA SureFire Ultra. Para la detección, se transfirieron 10 µL de lisado a una placa OptiPlate blanca de 384 pocillos, seguidos de 5 µL de mezcla aceptora y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Finalmente, se añadieron 5 µL de mezcla donadora a cada pocillo y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en oscuridad. La placa se leyó en un Envision con la configuración estándar de AlphaLISA.
El número aproximado de células por punto de datos se indica en el gráfico. El ensayo puede detectar IRF4 total hasta 200 células.
Aplicación: Señalización celular
Compatible con automatización: Sí
Marca AlphaLISA SureFire Ultra
Modalidad de detección alfa
Tiempo de protocolo: 2 h a temperatura ambiente
Volumen de muestra: 30 µL
Condiciones de envío - Envío en Blue Ice
Objetivo-IRF4
Clase objetivo: fosfoproteínas
Especie objetivo: humanos
Tecnología-Alfa
Área terapéutica - Oncología de la inflamación
Tamaño de la unidad: 100 puntos de ensayo