Revvity, ALSU-TIRF8-A-HV, kit AlphaLISA de detección de IRF8 total en humanos y ratones, 100 puntos de ensayo

Descripción general
El factor regulador del interferón 8 (IRF8) es un factor de transcripción que desempeña funciones esenciales en el desarrollo de las células mieloides, la diferenciación de las células dendríticas y la respuesta inmunitaria a patógenos intracelulares. IRF8 forma complejos heterodiméricos con PU.1 para regular el compromiso del linaje mieloide, promoviendo el desarrollo de monocitos y células dendríticas. Es fundamental para el desarrollo de las células dendríticas clásicas y plasmocitoides, y regula la expresión de IL-12 e interferones tipo I. Las mutaciones de pérdida de función en IRF8 causan inmunodeficiencia grave con ausencia de células dendríticas. IRF8 funciona como supresor tumoral en la leucemia mieloide crónica y otras neoplasias malignas mieloides.
AlphaLISA SureFire Ultra Human and Mouse Total IRF8 es un inmunoensayo tipo sándwich para la detección cuantitativa de IRF8 total en lisados ​​celulares, utilizando tecnología Alpha.
Formatos:

El kit HV (alto volumen) contiene reactivos para ejecutar 100 pocillos en formato de 96 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 60 μL.
El kit de 500 puntos contiene suficientes reactivos para ejecutar 500 pocillos en formato de 384 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 20 μL.
El kit de 10 000 puntos contiene suficientes reactivos para ejecutar 10 000 pocillos en formato de 384 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 20 μL.
El kit de 50.000 puntos contiene suficientes reactivos para ejecutar 50.000 pocillos en formato de 384 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 20 μL.

Los kits AlphaLISA SureFire Ultra son compatibles con:

Lisados ​​de células y tejidos
Moduladores de anticuerpos
Anticuerpos bioterapéuticos

Los kits AlphaLISA SureFire Ultra se pueden utilizar para:

Ensayos de quinasas celulares
Estudios de activación de receptores
Cribado de alto rendimiento para estudios preclínicos
Cómo funciona
Principio del ensayo Total-AlphaLISA SureFire Ultra
El ensayo Total-AlphaLISA SureFire Ultra mide el nivel de expresión de una proteína objetivo en un lisado celular.
El ensayo Total-AlphaLISA SureFire Ultra utiliza dos anticuerpos que reconocen dos epítopos distales diferentes en la proteína diana. Los ensayos AlphaLISA requieren dos tipos de microesferas: aceptoras y donantes. Las microesferas aceptoras están recubiertas con un agente patentado CaptSure™ para inmovilizar específicamente el anticuerpo específico del ensayo, marcado con una etiqueta CaptSure. Las microesferas donantes están recubiertas con estreptavidina para capturar uno de los anticuerpos de detección, que está biotinilado. En presencia de la proteína diana, los dos anticuerpos acercan las microesferas donadoras y aceptoras, por lo que el oxígeno singlete transfiere energía para excitar la microesfera aceptora, lo que permite la generación de una señal alfa luminiscente. La cantidad de luz emitida es directamente proporcional a la cantidad de proteína presente en la muestra.

Protocolo de ensayo de dos placas Total-AlphaLISA SureFire Ultra
El protocolo de dos placas implica el cultivo y tratamiento de las células en una placa de 96 pocillos antes de la lisis, y la posterior transferencia de los lisados ​​a una placa OptiPlate™ de 384 pocillos antes de añadir los reactivos de detección Total-AlphaLISA SureFire Ultra. Este protocolo permite monitorizar la viabilidad y la confluencia celular. Además, los lisados ​​de un solo pocillo pueden utilizarse para medir múltiples dianas.

Protocolo de ensayo de una placa Total-AlphaLISA SureFire Ultra
La detección de la proteína diana total con los reactivos AlphaLISA SureFire Ultra se puede realizar en una sola placa, utilizada para cultivo, tratamiento y lisis. No requiere lavado. Este protocolo, diseñado por HTS, permite la miniaturización manteniendo la calidad de AlphaLISA SureFire Ultra.
Versatilidad de ensayos
Expresión diferencial de IRF8 en varias líneas celulares
Las células adherentes se cultivaron hasta confluencia en un matraz T175 a 37 °C y 5 % de CO₂, y se lisaron con tampón de lisis a una densidad de 0,5 x 10⁻ células/ml. Las células en suspensión se recogieron, se lavaron con HBSS y se lisaron con tampón de lisis a una densidad de 1,6 x 10⁻ células/ml.
Los niveles totales de IRF8 se evaluaron mediante el ensayo AlphaLISA SureFire Ultra. Para la detección, se transfirieron 10 µL de lisado celular a una placa OptiPlate blanca de 384 pocillos, seguidos de 5 µL de mezcla aceptora y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Finalmente, se añadieron 5 µL de mezcla donante a cada pocillo y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en oscuridad. La placa se leyó en un Envision con la configuración estándar de AlphaLISA.
Como se esperaba, la proteína IRF8 total está altamente expresada en líneas de células de linfoma B como RPMI 8226 y Karpas 299, sin que se detecte expresión en células Jurkat o A431.
Sensibilidad del ensayo
Sensibilidad del ensayo: lisado celular
El lisado celular se preparó a partir de células THP-1 lisadas a una densidad de 1,5 x 106 células/ml en tampón de lisis.
Los lisados ​​se diluyeron en serie en tampón de lisis y se analizaron los niveles de IRF8 con el kit AlphaLISA SureFire Ultra. Para la detección, se transfirieron 10 µL de lisado a una placa OptiPlate blanca de 384 pocillos, seguidos de 5 µL de mezcla aceptora y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Finalmente, se añadieron 5 µL de mezcla donadora a cada pocillo y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en oscuridad. La placa se leyó en un Envision con la configuración estándar de AlphaLISA.
El número aproximado de células por punto de datos se indica en el gráfico. La línea punteada representa el fondo del ensayo. El ensayo puede detectar IRF8 total hasta 200 células.
Aplicación: Señalización celular
Compatible con automatización: Sí
Marca AlphaLISA SureFire Ultra
Modalidad de detección alfa
Tiempo de protocolo: 2 h a temperatura ambiente
Volumen de muestra: 30 µL
Condiciones de envío - Envío en Blue Ice
Objetivo-IRF8
Clase objetivo: fosfoproteínas
Especie objetivo: ratón humano
Tecnología-Alfa
Área terapéutica-Inflamación
Tamaño de la unidad: 100 puntos de ensayo