Revvity, ALSU-TMFN2-A500, kit AlphaLISA para la detección de mitofusina 2 total en humanos y ratones, 500 puntos de ensayo

Descripción general
Las mitofusinas (MFN1 y MFN2) son GTPasas relacionadas con la dinamina en la membrana mitocondrial externa que median la fusión mitocondrial, esencial para mantener la morfología y la función mitocondriales. Las mitofusinas funcionan como anclajes moleculares que acercan las mitocondrias adyacentes, y la hidrólisis de GTP impulsa la fusión de la membrana. La MFN1 presenta una mayor actividad de fusión, mientras que la MFN2 desempeña funciones adicionales en la unión entre el RE y las mitocondrias. Las mutaciones en la MFN2 causan la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth tipo 2A, una neuropatía periférica causada por una alteración de la dinámica mitocondrial. La función alterada de la mitofusina está implicada en enfermedades metabólicas, trastornos neurodegenerativos y cáncer.
AlphaLISA SureFire Ultra Human and Mouse Total Mitofusin 2 es un inmunoensayo tipo sándwich para la detección cuantitativa de Mitofusina 2 total en lisados ​​celulares, utilizando tecnología Alpha.
Formatos:

El kit HV (alto volumen) contiene reactivos para ejecutar 100 pocillos en formato de 96 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 60 μL.
El kit de 500 puntos contiene suficientes reactivos para ejecutar 500 pocillos en formato de 384 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 20 μL.
El kit de 10 000 puntos contiene suficientes reactivos para ejecutar 10 000 pocillos en formato de 384 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 20 μL.
El kit de 50.000 puntos contiene suficientes reactivos para ejecutar 50.000 pocillos en formato de 384 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 20 μL.

Los kits AlphaLISA SureFire Ultra son compatibles con:

Lisados ​​de células y tejidos
Moduladores de anticuerpos
Anticuerpos bioterapéuticos

Los kits AlphaLISA SureFire Ultra se pueden utilizar para:

Ensayos de quinasas celulares
Estudios de activación de receptores
Cribado de alto rendimiento para estudios preclínicos
Cómo funciona
Principio del ensayo Total-AlphaLISA SureFire Ultra
El ensayo Total-AlphaLISA SureFire Ultra mide el nivel de expresión de una proteína objetivo en un lisado celular.
El ensayo Total-AlphaLISA SureFire Ultra utiliza dos anticuerpos que reconocen dos epítopos distales diferentes en la proteína diana. Los ensayos AlphaLISA requieren dos tipos de microesferas: aceptoras y donantes. Las microesferas aceptoras están recubiertas con un agente patentado CaptSure™ para inmovilizar específicamente el anticuerpo específico del ensayo, marcado con una etiqueta CaptSure. Las microesferas donantes están recubiertas con estreptavidina para capturar uno de los anticuerpos de detección, que está biotinilado. En presencia de la proteína diana, los dos anticuerpos acercan las microesferas donadoras y aceptoras, por lo que el oxígeno singlete transfiere energía para excitar la microesfera aceptora, lo que permite la generación de una señal alfa luminiscente. La cantidad de luz emitida es directamente proporcional a la cantidad de proteína presente en la muestra.

Protocolo de ensayo de dos placas Total-AlphaLISA SureFire Ultra
El protocolo de dos placas implica el cultivo y tratamiento de las células en una placa de 96 pocillos antes de la lisis, y la posterior transferencia de los lisados ​​a una placa OptiPlate™ de 384 pocillos antes de añadir los reactivos de detección Total-AlphaLISA SureFire Ultra. Este protocolo permite monitorizar la viabilidad y la confluencia celular. Además, los lisados ​​de un solo pocillo pueden utilizarse para medir múltiples dianas.

Protocolo de ensayo de una placa Total-AlphaLISA SureFire Ultra
La detección de la proteína diana total con los reactivos AlphaLISA SureFire Ultra se puede realizar en una sola placa, utilizada para cultivo, tratamiento y lisis. No requiere lavado. Este protocolo, diseñado por HTS, permite la miniaturización manteniendo la calidad de AlphaLISA SureFire Ultra.
Versatilidad de ensayos
Expresión de mitofusina 2 en varias líneas celulares
Las células adherentes se cultivaron hasta la confluencia en un matraz T175 a 37 °C, 5 % de CO2 y se lisaron con tampón de lisis a una densidad de 0,5 x 106 células/ml.
Los niveles de mitofusina 2 se evaluaron con AlphaLISA SureFire Ultra. Para la detección, se transfirieron 10 µL de lisado celular (5000 células) a una placa OptiPlate blanca de 384 pocillos, seguidos de 5 µL de mezcla aceptora y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Finalmente, se añadieron 5 µL de mezcla donante a cada pocillo y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en oscuridad. La placa se leyó en un Envision con la configuración estándar de AlphaLISA.
Se detectó la expresión de mitofusina 2 en una amplia gama de líneas celulares humanas y de ratón.
Sensibilidad del ensayo
Sensibilidad del ensayo de mitofusina 2

Las PBMC se aislaron de donantes sanos y se lisaron con tampón de lisis durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación (350 rpm). Los lisados ​​se diluyeron en serie en tampón de lisis y los niveles de mitofusina 2 se evaluaron con AlphaLISA SureFire Ultra. Para la detección, se transfirieron 10 µL de lisado celular (se indica el número aproximado de células) a una placa OptiPlate blanca de 384 pocillos, seguidos de 5 µL de mezcla aceptora y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Finalmente, se añadieron 5 µL de mezcla donante a cada pocillo y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en oscuridad. La placa se leyó en un Envision con la configuración estándar de AlphaLISA.
Se detectó la expresión de mitofusina 2 en PBMC en menos de 500 células/punto de datos.

El lisado celular se preparó a partir de células HeLa cultivadas hasta confluencia en un matraz T175 lisadas en 8 ml de tampón de lisis durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación.
El lisado se diluyó en serie en tampón de lisis y los niveles de mitofusina 2 se evaluaron con AlphaLISA SureFire Ultra. Para la detección, se transfirieron 10 µL de lisado celular a una placa OptiPlate blanca de 384 pocillos, seguidos de 5 µL de mezcla aceptora y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Finalmente, se añadieron 5 µL de mezcla donadora a cada pocillo y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en oscuridad. La placa se leyó en un Envision con la configuración estándar de AlphaLISA.
Se indica el número aproximado de células. La línea punteada representa el fondo del ensayo. El ensayo de Mitofusina 2 tiene un amplio rango dinámico y puede detectar la expresión de Mitofusina 2 en menos de 100 células/punto de datos.
Aplicación: Señalización celular
Compatible con automatización: Sí
Marca AlphaLISA SureFire Ultra
Modalidad de detección alfa
Tiempo de protocolo: 2 h a temperatura ambiente
Volumen de muestra: 10 µL
Condiciones de envío - Envío en Blue Ice
Objetivo-Mitofusina 2
Clase objetivo: fosfoproteínas
Especie objetivo: ratón humano
Tecnología-Alfa
Área terapéutica-Neurociencia metabólica oncológica
Tamaño de la unidad: 500 puntos de ensayo