Revvity, ALSU-TNECT4-A10K, kit de detección de nectina-4 total humana AlphaLISA, 10 000 puntos de ensayo

Descripción general
La nectina-4 (PVRL4) es una molécula de adhesión celular que regula las uniones intercelulares, la arquitectura tisular y la progresión tumoral. La nectina-4 media las interacciones homofílicas y heterófilas, contribuyendo a la formación de uniones adherentes y a la polaridad de las células epiteliales. Presenta una expresión restringida en tejidos adultos normales, pero se sobreexpresa en numerosos cánceres epiteliales, como los carcinomas uroteliales, de mama y de pulmón. Esta expresión restringida en tejidos normales convierte a la nectina-4 en una diana terapéutica atractiva para los conjugados anticuerpo-fármaco. Enfortumab vedotina, un ADC dirigido a la nectina-4, ha demostrado una eficacia significativa en el carcinoma urotelial avanzado, lo que la convierte en una diana terapéutica validada.
AlphaLISA SureFire Ultra Human Total Nectin-4 es un inmunoensayo tipo sándwich para la detección cuantitativa de nectina-4 total en lisados ​​celulares, utilizando tecnología Alpha.
Formatos:

El kit HV (alto volumen) contiene reactivos para ejecutar 100 pocillos en formato de 96 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 60 μL.
El kit de 500 puntos contiene suficientes reactivos para ejecutar 500 pocillos en formato de 384 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 20 μL.
El kit de 10 000 puntos contiene suficientes reactivos para ejecutar 10 000 pocillos en formato de 384 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 20 μL.
El kit de 50.000 puntos contiene suficientes reactivos para ejecutar 50.000 pocillos en formato de 384 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 20 μL.

Los kits AlphaLISA SureFire Ultra son compatibles con:

Lisados ​​de células y tejidos
Moduladores de anticuerpos
Anticuerpos bioterapéuticos

Los kits AlphaLISA SureFire Ultra se pueden utilizar para:

Ensayos de quinasas celulares
Estudios de activación de receptores
Cribado de alto rendimiento para estudios preclínicos
Cómo funciona
Principio del ensayo Total-AlphaLISA SureFire Ultra
El ensayo Total-AlphaLISA SureFire Ultra mide el nivel de expresión de una proteína objetivo en un lisado celular.
El ensayo Total-AlphaLISA SureFire Ultra utiliza dos anticuerpos que reconocen dos epítopos distales diferentes en la proteína diana. Los ensayos AlphaLISA requieren dos tipos de microesferas: aceptoras y donantes. Las microesferas aceptoras están recubiertas con un agente patentado CaptSure™ para inmovilizar específicamente el anticuerpo específico del ensayo, marcado con una etiqueta CaptSure. Las microesferas donantes están recubiertas con estreptavidina para capturar uno de los anticuerpos de detección, que está biotinilado. En presencia de la proteína diana, los dos anticuerpos acercan las microesferas donadoras y aceptoras, por lo que el oxígeno singlete transfiere energía para excitar la microesfera aceptora, lo que permite la generación de una señal alfa luminiscente. La cantidad de luz emitida es directamente proporcional a la cantidad de proteína presente en la muestra.

Protocolo de ensayo de dos placas Total-AlphaLISA SureFire Ultra
El protocolo de dos placas implica el cultivo y tratamiento de las células en una placa de 96 pocillos antes de la lisis, y la posterior transferencia de los lisados ​​a una placa OptiPlate™ de 384 pocillos antes de añadir los reactivos de detección Total-AlphaLISA SureFire Ultra. Este protocolo permite monitorizar la viabilidad y la confluencia celular. Además, los lisados ​​de un solo pocillo pueden utilizarse para medir múltiples dianas.

Protocolo de ensayo de una placa Total-AlphaLISA SureFire Ultra
La detección de la proteína diana total con los reactivos AlphaLISA SureFire Ultra se puede realizar en una sola placa, utilizada para cultivo, tratamiento y lisis. No requiere lavado. Este protocolo, diseñado por HTS, permite la miniaturización manteniendo la calidad de AlphaLISA SureFire Ultra.
Versatilidad de ensayos
Expresión de nectina-4 en varias líneas celulares
Las células se sembraron a 40 000 células/pocillo en una placa de cultivo de 96 pocillos en medio completo y se incubaron durante la noche a 37 °C, 5 % de CO2 y se lisaron con 100 µL de tampón de lisis.
Los niveles de nectina-4 se evaluaron con AlphaLISA SureFire Ultra. Para la detección, se transfirieron 10 µL de lisado celular (4000 células) a una placa OptiPlate blanca de 384 pocillos, seguidos de 5 µL de mezcla aceptora y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Finalmente, se añadieron 5 µL de mezcla donante a cada pocillo y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en oscuridad. La placa se leyó en un Envision con la configuración estándar de AlphaLISA.

Regulación de la liberación de nectina-4
Se sembraron células A431 en una placa de 96 pocillos (40.000 células/pocillo) en medio completo y se incubaron durante la noche a 37 °C y 5 % de CO₂. Las células se colocaron en DMEM fresco y se dejaron sin tratar o se trataron con 5 nM de PMA -/+ 25 µM de GW280264X durante 24 horas.
Se extrajo el sobrenadante celular y se evaluaron los niveles de nectina-4 con AlphaLISA SureFire Ultra. Para la detección, se transfirieron 10 µL de sobrenadante a una placa OptiPlate blanca de 384 pocillos, seguidos de 5 µL de mezcla aceptora y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Finalmente, se añadieron 5 µL de mezcla donadora a cada pocillo y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en oscuridad. La placa se leyó en un Envision con la configuración estándar de AlphaLISA.
Como se esperaba, PMA estimula la liberación de Nectin-4 en el sobrenadante, y esto es inhibido por el inhibidor de metaloproteasa GW280264X.
Sensibilidad del ensayo
Sensibilidad del ensayo de nectina-4

La sensibilidad del ensayo de nectina-4 total se evaluó evaluando la proteína nectina-4 recombinante.
Se prepararon diluciones de la proteína nectina-4 recombinante (Abcam ab307789) en tampón de lisis y se evaluaron con el ensayo AlphaLISA SureFire Ultra. Para la detección, se transfirieron 10 µL de proteína a una placa OptiPlate blanca de 384 pocillos, seguidos de 5 µL de mezcla aceptora y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Finalmente, se añadieron 5 µL de mezcla donadora a cada pocillo y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en oscuridad. La placa se leyó en un Envision con la configuración estándar de AlphaLISA.

El lisado celular se preparó a partir de células A431 cultivadas hasta confluencia en un matraz T175 y se lizaron en 4 ml de tampón de lisis durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación.
El lisado se diluyó en serie en tampón de lisis y se evaluaron los niveles de nectina-4 con AlphaLISA SureFire Ultra. Para la detección, se transfirieron 10 µL de lisado celular a una placa OptiPlate blanca de 384 pocillos, seguido de 5 µL de mezcla aceptora y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Finalmente, se añadieron 5 µL de mezcla donadora a cada pocillo y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente en oscuridad. La placa se leyó en un Envision con la configuración estándar de AlphaLISA.
Se indica el número aproximado de células. La línea punteada representa el fondo del ensayo. El ensayo de nectina-4 puede detectar la expresión de nectina-4 en menos de 1000 células/punto de datos.
Aplicación: Señalización celular
Compatible con automatización: Sí
Marca AlphaLISA SureFire Ultra
Modalidad de detección alfa
Tiempo de protocolo: 2 h a temperatura ambiente
Volumen de muestra: 10 µL
Condiciones de envío - Envío en Blue Ice
Objetivo-Nectin-4
Clase objetivo: fosfoproteínas
Especie objetivo: humanos
Tecnología-Alfa
Área Terapéutica-Oncología
Tamaño de la unidad: 10 000 puntos de ensayo