Revvity, ALSU-TSM3-B-HV, AlphaLISA Kit de detección de SMAD3 total de alta especificidad en humanos y ratones, 100 puntos de ensayo

Descripción general
SMAD3 es un transductor de señales intracelular y factor de transcripción que media la señalización de TGF-β y activina para regular el crecimiento celular, la diferenciación y la producción de la matriz extracelular. Tras la activación del receptor TGF-β, SMAD3 se fosforila, lo que permite la formación de complejos con SMAD4 que se translocan al núcleo. El complejo SMAD3/SMAD4 regula la transcripción de genes, como colágenos, fibronectina e inhibidores de cinasas dependientes de ciclina. SMAD3 desempeña funciones dependientes del contexto como supresor y promotor tumoral. La pérdida de SMAD3 contribuye al cáncer colorrectal, mientras que su activación excesiva provoca fibrosis patológica en múltiples órganos.
AlphaLISA SureFire Ultra Human and Mouse High Specificity Total SMAD3 es un inmunoensayo tipo sándwich para la detección cuantitativa de SMAD3 total en lisados ​​celulares, utilizando tecnología Alpha.
Formatos:

El kit HV (alto volumen) contiene reactivos para ejecutar 100 pocillos en formato de 96 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 60 μL.
El kit de 500 puntos contiene suficientes reactivos para ejecutar 500 pocillos en formato de 384 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 20 μL.
El kit de 10 000 puntos contiene suficientes reactivos para ejecutar 10 000 pocillos en formato de 384 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 20 μL.
El kit de 50.000 puntos contiene suficientes reactivos para ejecutar 50.000 pocillos en formato de 384 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 20 μL.

Los kits AlphaLISA SureFire Ultra son compatibles con:

Lisados ​​de células y tejidos
Moduladores de anticuerpos
Anticuerpos bioterapéuticos

Los kits AlphaLISA SureFire Ultra se pueden utilizar para:

Ensayos de quinasas celulares
Estudios de activación de receptores
Cribado de alto rendimiento para estudios preclínicos
Cómo funciona
Principio del ensayo Total-AlphaLISA SureFire Ultra
El ensayo Total-AlphaLISA SureFire Ultra mide el nivel de expresión de una proteína objetivo en un lisado celular.
El ensayo Total-AlphaLISA SureFire Ultra utiliza dos anticuerpos que reconocen dos epítopos distales diferentes en la proteína diana. Los ensayos AlphaLISA requieren dos tipos de microesferas: aceptoras y donantes. Las microesferas aceptoras están recubiertas con un agente patentado CaptSure™ para inmovilizar específicamente el anticuerpo específico del ensayo, marcado con una etiqueta CaptSure. Las microesferas donantes están recubiertas con estreptavidina para capturar uno de los anticuerpos de detección, que está biotinilado. En presencia de la proteína diana, los dos anticuerpos acercan las microesferas donadoras y aceptoras, por lo que el oxígeno singlete transfiere energía para excitar la microesfera aceptora, lo que permite la generación de una señal alfa luminiscente. La cantidad de luz emitida es directamente proporcional a la cantidad de proteína presente en la muestra.

Protocolo de ensayo de dos placas Total-AlphaLISA SureFire Ultra
El protocolo de dos placas implica el cultivo y tratamiento de las células en una placa de 96 pocillos antes de la lisis, y la posterior transferencia de los lisados ​​a una placa OptiPlate™ de 384 pocillos antes de añadir los reactivos de detección Total-AlphaLISA SureFire Ultra. Este protocolo permite monitorizar la viabilidad y la confluencia celular. Además, los lisados ​​de un solo pocillo pueden utilizarse para medir múltiples dianas.

Protocolo de ensayo de una placa Total-AlphaLISA SureFire Ultra
La detección de la proteína diana total con los reactivos AlphaLISA SureFire Ultra se puede realizar en una sola placa, utilizada para cultivo, tratamiento y lisis. No requiere lavado. Este protocolo, diseñado por HTS, permite la miniaturización manteniendo la calidad de AlphaLISA SureFire Ultra.
Versatilidad de ensayos
Versatilidad del ensayo SMAD3 Total (HS) en diversas líneas celulares
Las células adherentes se cultivaron hasta confluencia en un matraz T175 a 37 °C y 5 % de CO₂, y se lisaron con tampón de lisis a una densidad de 1 x 10⁻¹ células/ml. Las células en suspensión se recogieron, se lavaron con HBSS y se lisaron con tampón de lisis a una densidad de 3,2 x 10⁻¹ células/ml.
Los niveles totales de SMAD3 se evaluaron mediante el ensayo AlphaLISA SureFire de especificidad ultraalta. Para la detección, se transfirieron 10 µL de lisado celular (10 000 células adherentes y 32 000 células en suspensión) a una placa OptiPlate blanca de 384 pocillos, seguido de 5 µL de mezcla aceptora y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Finalmente, se añadieron 5 µL de mezcla donante a cada pocillo y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente en oscuridad. La placa se leyó en un analizador Envision con la configuración estándar de AlphaLISA.
Se detectó la expresión total de SMAD3 en una amplia gama de líneas celulares humanas y de ratón.
Sensibilidad del ensayo
Sensibilidad del ensayo: lisado celular
El lisado celular se preparó a partir de células RAW 264.7 cultivadas hasta confluencia en un matraz T175 y estimuladas con 50 ng/mL de TGF-β durante 90 minutos. Las células se lisaron con 6 mL de tampón de lisis durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación.
El lisado se diluyó en serie en tampón de lisis y SMAD3 fosfo (Ser423/425). Los niveles totales se evaluaron mediante ensayos AlphaLISA SureFire de ultra alta especificidad. Para la detección, se transfirieron 10 µL de lisado a una placa OptiPlate blanca de 384 pocillos, seguidos de 5 µL de mezcla aceptora y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Finalmente, se añadieron 5 µL de mezcla donadora a cada pocillo y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en oscuridad. La placa se leyó en un Envision con la configuración estándar de AlphaLISA.
Se indica el número aproximado de células por punto de datos. La línea punteada representa el fondo del ensayo. El ensayo puede detectar SMAD3 Total hasta 2500 células por punto de datos.
Aplicación: Señalización celular
Compatible con automatización: Sí
Marca AlphaLISA SureFire Ultra
Modalidad de detección alfa
Tiempo de protocolo: 2 h a temperatura ambiente
Volumen de muestra: 30 µL
Condiciones de envío - Envío en Blue Ice
Objetivo-SMAD3
Clase objetivo: fosfoproteínas
Especie objetivo: ratón humano
Tecnología-Alfa
Área terapéutica - Inflamación NASH/Fibrosis Oncológica
Tamaño de la unidad: 100 puntos de ensayo