Revvity, ASBF-PCYCE1-A10K, kit de detección de fosfociclina E1 humana sin biotina AlphaLISA (Thr77), 10 000 puntos de ensayo

Descripción general
La ciclina E1 es una proteína reguladora que controla la transición de la fase G1 a la fase S del ciclo celular mediante la activación de la quinasa dependiente de ciclina 2 (CDK2). El complejo ciclina E1-CDK2 fosforila sustratos como la proteína del retinoblastoma y p27Kip1, lo que promueve el inicio de la replicación del ADN. La sobreexpresión o amplificación de la ciclina E1 se produce en numerosos cánceres, como los carcinomas de mama, ovario y endometrio, lo que provoca una proliferación descontrolada y la inestabilidad cromosómica. Las formas de bajo peso molecular de la ciclina E1 presentan una mayor actividad oncogénica y resistencia a los inhibidores de CDK. Se están desarrollando inhibidores selectivos de CDK2 como terapia para los cánceres con amplificación de la ciclina E1.
El kit de detección de fosfociclina E1 humana sin biotina AlphaLISA SureFire es un inmunoensayo tipo sándwich para la detección cuantitativa de fosfociclina E1 (Thr77) en lisados ​​celulares, utilizando tecnología Alpha.
Formatos:

El kit HV (alto volumen) contiene reactivos para ejecutar 100 pocillos en formato de 96 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 60 μL.
El kit de 500 puntos contiene suficientes reactivos para ejecutar 500 pocillos en formato de 384 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 20 μL.
El kit de 10 000 puntos contiene suficientes reactivos para ejecutar 10 000 pocillos en formato de 384 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 20 μL.
El kit de 50.000 puntos contiene suficientes reactivos para ejecutar 50.000 pocillos en formato de 384 pocillos, utilizando un volumen de reacción de 20 μL.

Los kits AlphaLISA SureFire Biotin Free son compatibles con:

Lisados ​​de células y tejidos
Moduladores de anticuerpos
Anticuerpos bioterapéuticos
Muestras ricas en biotina

Los kits AlphaLISA SureFire Biotin Free se pueden utilizar para:

Ensayos de quinasas celulares
Estudios de activación de receptores
Cribado de alto rendimiento para estudios preclínicos
Cómo funciona
Principio del ensayo Phospho-AlphaLISA SureFire Biotin Free
El ensayo Phospho-AlphaLISA SureFire Biotin Free mide un objetivo proteico cuando se fosforila en un residuo específico.
El ensayo utiliza dos anticuerpos que reconocen el epítopo fosforilado y un epítopo distal en la proteína diana. Los ensayos AlphaLISA requieren dos tipos de microesferas: aceptoras y donantes. Las microesferas aceptoras están recubiertas con un agente patentado CaptSure™ para inmovilizar específicamente el anticuerpo específico del ensayo, marcado con una etiqueta CaptSure. Las microesferas donantes están recubiertas con un agente patentado CaptSure 3 para capturar uno de los anticuerpos de detección, marcado con una etiqueta CaptSure 3. En presencia de proteína fosforilada, los dos anticuerpos acercan las microesferas donadora y aceptora, por lo que el oxígeno singlete transfiere energía para excitar la microesfera aceptora, lo que permite la generación de una señal alfa luminiscente. La cantidad de emisión de luz es directamente proporcional a la cantidad de fosfoproteína presente en la muestra.

Protocolo de ensayo de dos placas sin biotina Phospho-AlphaLISA SureFire
El protocolo de dos placas implica el cultivo y tratamiento de las células en una placa de 96 pocillos antes de la lisis, y la posterior transferencia de los lisados ​​a una placa Optiplate™ de 384 pocillos antes de añadir los reactivos de detección Phospho-AlphaLISA SureFire Biotin Free. Este protocolo permite monitorizar la viabilidad y la confluencia celular. Además, los lisados ​​de un solo pocillo pueden utilizarse para medir múltiples dianas.

Protocolo de ensayo de una placa sin biotina Phospho-AlphaLISA SureFire
La detección de la proteína diana fosforilada con los reactivos AlphaLISA SureFire Biotin Free se puede realizar en una sola placa para cultivo, tratamiento y lisis. No requiere lavado. Este protocolo, diseñado para HTS, permite la miniaturización manteniendo la robusta calidad de AlphaLISA SureFire.
Sensibilidad del ensayo
Sensibilidad del ensayo: dilución del lisado celular
El lisado celular se preparó a partir de células BeWo cultivadas hasta confluencia en un matraz T175 y se lizaron en 3 ml de tampón de lisis durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación.
El lisado se diluyó en serie en tampón de lisis y ciclina E1 fosfo (Thr77), y los niveles totales se evaluaron con AlphaLISA SureFire Biotin Free. Para la detección, se transfirieron 10 µL de lisado a una placa OptiPlate blanca de 384 pocillos, seguidos de 5 µL de mezcla aceptora y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Finalmente, se añadieron 5 µL de mezcla donadora a cada pocillo y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en oscuridad. La placa se leyó en un Envision con la configuración estándar de AlphaLISA.
Se indica el número aproximado de células por punto de datos. La línea punteada representa el fondo del ensayo. Este ensayo puede detectar ciclina E1 fosfo (Thr77) hasta 200 células por punto de datos.
Aplicación: Señalización celular
Compatible con automatización: Sí
Marca AlphaLISA SureFire Ultra
Modalidad de detección alfa
Tiempo de protocolo: 2 h a temperatura ambiente
Volumen de muestra: 10 µL
Condiciones de envío - Envío en Blue Ice
Objetivo-ciclina E1
Clase objetivo: fosfoproteínas
Especie objetivo: humanos
Tecnología-Alfa
Área Terapéutica-Oncología
Tamaño de la unidad: 10 000 puntos de ensayo