Revvity, PT8HALONEO, plásmido pT8-HaloTag (neomicina) Tag-lite, 10 µg

Descripción general
En los últimos años, la tecnología SNAP-Tag, combinada con TR-FRET, ha allanado el camino para el desarrollo de numerosos ensayos de unión no radiactivos y sin lavado. El método se basa en la transfección de células mediante plásmidos que codifican una etiqueta SNAP y su posterior marcaje con terbio. PT8HALONEO es una estructura principal que contiene el gen para la etiqueta HALO, un promotor, un gen de resistencia a la neomicina y un sitio de clonación múltiple (MCS).
Los ensayos Tag-lite ofrecen muchas características y aplicaciones en comparación con los ensayos tradicionales de unión de receptor/ligando:

No radiactivo
Homogéneo y sin filtración
Kits y reactivos listos para usar para ensayos de unión
No altera la farmacología del receptor.
Tecnología validada y revisada por pares
Estudios cinéticos exhaustivos con valores reales de Kd y Ki, constantes de velocidad de asociación (Kon) y disociación (Koff)
Cribado y elaboración de perfiles de productos biológicos y moléculas grandes
Cómo funciona
Paso 1 - Creación del plásmido
Utilizando técnicas de clonación estándar, inserte el gen GPCR de interés en el plásmido vacío. Recuerde que, al diseñar un plásmido, el gen GPCR debe mantenerse en el marco.

Paso 2 - Transfección del plásmido
Utilice técnicas de transfección estándar (consulte el protocolo de transfección transitoria) para expresar transitoriamente el SNAP-GPCR de interés en su línea celular.

Paso 3 - Etiquetado del receptor
SNAP-tag® es una pequeña etiqueta de fusión que interactúa covalentemente con sustratos específicos. SNAP-tag permite el marcaje específico y covalente de cualquier proteína de interés. Las células se suministran sin marcar y deben marcarse con Lumi4-Terbio antes de realizar un ensayo de unión. Los reactivos de marcaje están disponibles en el catálogo de Revvity en cuatro tamaños diferentes. Para más detalles, consulte el procedimiento de marcaje.

Paso 4: Comprender el principio del ensayo
Realizar un ensayo de unión al receptor con Tag-lite es facilísimo. Simplemente dispense 10 µL de células marcadas en cada pocillo, seguido de 5 µL de ligando marcado y 5 µL del compuesto que desea analizar. Como todos los ensayos HTRF, los ensayos Tag-lite no requieren lavado. A la derecha se muestra un diagrama del procedimiento.

Paso 5 - Unión de saturación (KD)
Un ensayo de unión por saturación mide la unión total e inespecífica para concentraciones crecientes de ligando en condiciones de equilibrio. Para realizar el ensayo, el ligando fluorescente se titula en una solución que contiene una cantidad fija de células marcadas y se incuba hasta alcanzar el equilibrio. El índice HTRF obtenido de esta titulación es la unión total.

Paso 6 - Enlace competitivo (KI)
Se realiza un ensayo de unión competitiva para medir la constante de disociación, Ki. Para realizar el ensayo, el compuesto se titula en una solución que contiene una concentración fija de ligando fluorescente y una cantidad fija de células. Aplicación: Unión Receptor-Ligando.
Etiqueta de marca ligera
Modalidad de detección-HTRF
Grupo de productos: plásmidos
Condiciones de envío - Envío en hielo seco
Clase objetivo-GPCR
Tecnología-TR-FRET
Área terapéutica - Enfermedades infecciosas cardiovasculares Metabolismo/Diabetes EHNA/Fibrosis Neurociencia Oncología e inflamación Enfermedades raras
Tamaño de la unidad: 10 mg