Thermo Fisher, 20163, Kit de destiobiotinilación del extremo 3' de ARN Pierce™ Thermo Scientific™

Kit de destiobiotinilación del extremo 3' del ARN Pierce™ Thermo Scientific™ El kit de destiobiotinilación del extremo 3' del ARN Pierce de Thermo Scientific contiene reactivos para un etiquetado de destiobiotina del ARN fácil y eficiente para su uso como sondas o como alternativas de anticuerpos para el enriquecimiento de proteínas de unión al ARN.
Características del kit de destiobiotinilación del extremo 3' del ARN:
•No radiactivo: una sola etiqueta de biotina tiene una sensibilidad de detección similar a la radiactividad.
•Fácil de usar: se incluyen ligasa de ARN y tampón de reacción optimizado.
•Económico: solo una fracción del costo de comprar sondas de ARN biotiniladas sintéticas
•Etiquetado en el extremo: produce una alteración mínima de la estructura secundaria del ARN.
•Flexible: el marcador de destiobiotina puede usarse para la detección o como marcador de afinidad para la resina de estreptavidina. El kit Pierce de destiobiotinilación del extremo 3' del ARN está optimizado para el marcado del extremo 3' del ARN monocatenario mediante la ARN ligasa T4. Una vez marcado, el ARN puede usarse como sonda o diana para reacciones EMSA por desplazamiento en gel, transferencias Northern y experimentos de interacción proteína-ARN. El ARN destiobiotinilado también puede usarse para enriquecer proteínas de unión al ARN (RBP) mediante resina de afinidad para estreptavidina, ya que el marcador de destiobiotina se une a la estreptavidina de forma que permite una elución suave del complejo ribonucleoproteico. El kit de marcado también se incluye como componente del kit de pull-down magnético de ARN-proteína Thermo Scientific Pierce.
Incluye: Bisfosfato de citidina destiobiotinilado, ligasa de ARN T4 y tampón, oligonucleótido de ARN sin marcar para usar como control positivo, un estándar de sonda de ARN biotinilado, inhibidor de ARNasa, glucógeno y reactivos que mejoran la ligadura. Aplicaciones:
• Transferencia Northern
• Agencia Europea de Seguridad Alimentaria
Enriquecimiento de proteínas de unión a ARN (RBP). Este kit de marcaje de ARN utiliza la ARN ligasa T4 para unir un único bisfosfato de citidina destiobiotinilado al extremo 3' del ARN monocatenario. Cada reacción de marcaje se diseñó para 50 pmol de ARN; sin embargo, las reacciones pueden escalarse (se han probado de 1 pmol a 1 nmol) si es necesario. La reacción utiliza un exceso de nucleótido destiobiotinilado de 20 veces y requiere tiempos de incubación que van desde 30 minutos a 37 °C (para ARN menos complejo) hasta toda la noche a entre 4 y 16 °C (para ARN más largo o complejo). La eficiencia del marcaje para estructuras de ARN complejas se optimiza modificando la relación ARN:nucleótido, aumentando el tiempo de incubación o añadiendo DMSO para relajar la estructura del ARN. Tras la extracción orgánica y la precipitación con etanol, el ARN marcado con destiobiotina está listo para su uso en aplicaciones posteriores.
Experimentos de ejemplo con diferentes moléculas de ARN demuestran la robustez de la reacción de ligadura. Se evaluaron el ARN sintético y el ARN transcrito in vitro, y la eficiencia de las ligaduras se determinó mediante un análisis de punto semicuantitativo utilizando un ARN sintético biotinilado como control 100% marcado (Tabla). Todas las eficiencias de ligadura fueron superiores al 50%, y muchas superaron el 70%. El ARN control del kit presentó una eficiencia superior al 90% y sirve como indicador de las condiciones generales de reacción y los reactivos. Se requirió una mayor optimización para el ARN con una estructura secundaria significativa, y se requirió el replegamiento del ARN transcrito in vitro tras la ligadura.
Un ensayo de pull-down que involucra la interacción del miRNA let-7:Lin28 demuestra la funcionalidad experimental del ARN marcado con destiobiotinilado. La proteína Lin28, regulada durante el desarrollo, es un inhibidor selectivo del procesamiento del miRNA let-7 mediante su unión a una región de bucle del pre-miRNA let-7. Para evaluar esta interacción, la porción de bucle del miRNA let-7 se marcó en el extremo con citidina destiobiotinilada y se unió a microesferas magnéticas de estreptavidina. Posteriormente, las microesferas se incubaron con lisado de células de carcinoma embrionario (NCCIT) en tampón de unión proteína-ARN. Las muestras se eluyeron y se analizaron mediante Western blot. Los resultados indican que el miRNA let-7 marcado enriqueció específicamente la proteína Lin28 del lisado NCCIT, mientras que un ARN no relacionado no lo hizo.
Este kit también está incluido en el kit de extracción de proteína y ARN magnético Pierce y utiliza el kit de etiquetado junto con tampones de unión, lavado y elución optimizados para enriquecer las proteínas de unión al ARN.
Tecnología de aislamiento: Perlas magnéticas
Número de reacciones: 20
Línea de productos: Pierce™
Tipo de producto: Kit de etiquetado de ARN
Cantidad: 20 Reacciones
Formato: Kit
Tamaño de la unidad: cada una