Thermo Fisher, 4387299, Kit de preamplificador de celdas a CT™ TaqMan™

Kit TaqMan™ PreAmp Cells-to-CT™. El kit Ambion™ TaqMan PreAmp Cells-to-CT permite realizar análisis de expresión génica directamente a partir de un número limitado o pequeño de células cultivadas sin purificación de ARN. El protocolo incluye un paso intermedio de amplificación (preamplificación) entre la transcripción inversa y la PCR en tiempo real, en el que el ADNc se enriquece para hasta 100 dianas génicas a elección del usuario sin sesgo de amplificación.
• Solución completa y validada: el flujo de trabajo optimizado incluye reactivos de lisis celular, DNasa, reactivos RT, reactivos PreAmp y TaqMan™ Gene Expression Master Mix.
• Rápido, simple y conveniente: prepare muestras en 7 minutos; elimine el tedioso aislamiento de ARN
• Amplíe muestras limitadas: aumente el potencial de PCR en tiempo real hasta 64 veces; estudie hasta 100 genes a la vez
• Resultados precisos: amplificación uniforme sin introducir sesgos
• Rendimiento robusto: detección lineal de 10 a 100 000 células; resultados equivalentes al ARN purificado. Solución completa y validada. Con un método único para lisar células cultivadas mientras se elimina el ADN genómico y se preserva la integridad del ARN, el kit TaqMan™ PreAmp Cells-to-CT™ contiene reactivos de transcripción inversa (RT) para la síntesis de ADNc, TaqMan™ PreAmp Master Mix para la preamplificación de hasta 100 genes diana y TaqMan™ Gene Expression Master Mix para el análisis de PCR en tiempo real.
Preparación de muestras sencilla y práctica en 7 minutos. El kit TaqMan™ PreAmp Cells-to-CT™ incorpora un sencillo procedimiento de preparación de muestras de 7 minutos (Figura 1) para su uso con 10–100 000 células cultivadas por muestra. Las células se lavan en PBS y se lisan en solución durante 5 minutos a temperatura ambiente; el tratamiento con DNasa puede realizarse simultáneamente. La lisis finaliza a temperatura ambiente mediante una incubación de 2 minutos con solución de parada.
Los lisados ​​ya están listos para la transcripción inversa o el almacenamiento a –20 °C. Dado que las muestras pueden procesarse directamente en placas de cultivo (96 o 384 pocillos), se minimiza la manipulación de las muestras y la posibilidad de pérdida o error de transferencia, lo que facilita la extensión de muestras limitadas. No se requiere calentamiento, lavado ni centrifugación; el kit simplifica enormemente un proceso tradicionalmente laborioso y laborioso, reduciéndolo a 7 minutos.
Ampliación de muestras limitadas: aumenta el potencial de PCR en tiempo real hasta 64 vecesLa integración de la tecnología Cells-to-CT™ con capacidad de preamplificación agiliza un flujo de trabajo de varios pasos al tiempo que amplía significativamente (más de 60 veces) la cantidad de reacciones de PCR posibles a partir de muestras valiosas y aumenta la sensibilidad de la detección de ARNm a partir de pequeñas cantidades de entrada de muestra.
La reacción estándar de PCR en tiempo real para el análisis de la expresión génica comienza con la transcripción inversa del ARN total a ADNc mediante cebadores aleatorios y oligo dT, seguida de PCR en tiempo real con cebadores y sondas específicos para cada gen (Figura 2). Con el kit TaqMan™ PreAmp Cells-to-CT™, se realiza un paso intermedio de amplificación (preamplificación) entre la transcripción inversa y la PCR en tiempo real, en el que el ADNc se enriquece con hasta 100 dianas génicas a elección del usuario, sin sesgo de amplificación. La reacción preamplificada resultante se diluye y sirve como material de partida para los ensayos de expresión génica TaqMan™ individuales posteriores, utilizando la mezcla maestra TaqMan™ Gene Expression Master Mix, incluida en el kit. El proceso TaqMan™ PreAmp extiende eficazmente las muestras hasta 64 veces, lo que permite análisis que antes no eran posibles con un material de muestra limitado.
Resultados precisos: amplificación uniforme sin sesgo. La capacidad de realizar una preamplificación fiable y uniforme es fundamental para el análisis de la expresión génica a partir de muestras limitadas. Si bien existen otros métodos para preamplificar ARN o ADNc, utilizan un cebado no específico para amplificar el material de partida, lo que da como resultado una amplificación sesgada e inexacta de algunas transcripciones sobre otras. TaqMan™ PreAmp Master Mix, parte del kit TaqMan™ PreAmp Cells-to-CT™, utiliza cebadores específicos de genes para preamplificar el ADNc, lo que da como resultado una amplificación imparcial. El kit TaqMan™ PreAmp Cells-to-CT™ demuestra una preamplificación imparcial equivalente al ARN purificado cuando se compara con 100 ensayos de expresión génica TaqMan diferentes. Como se muestra en la Figura 3, la reacción de preamplificación no introduce sesgo de los lisados ​​de Cells-to-CT™ ni de las muestras purificadas; ≥ 92% de los ensayos estuvieron dentro de +⁄- 1.
5 ΔΔ CT para ADNc preamplificado frente a no amplificado, ya sea de ARN purificado (A) o de lisados ​​del kit Cells-to-CT™ (B).
Rendimiento robusto: resultados equivalentes al ARN purificado. El rendimiento del kit TaqMan™ PreAmp Cells-to-CT™ se evaluó con 100 ensayos TaqMan™ diferentes, utilizando lisados ​​Cells-to-CT™ o ARN purificado, con o sin preamplificación. Como se muestra en la Figura 4, los valores de CT obtenidos con los lisados ​​del kit TaqMan™ PreAmp Cells-to-CT™ fueron equivalentes, y con frecuencia superiores, a los obtenidos con ARN purificado, ya sea antes (A) o después de la preamplificación (B). El alto rendimiento de los lisados ​​del kit TaqMan™ PreAmp Cells-to-CT™ se debe a la conservación del ARN en las muestras iniciales sin pérdidas por calentamiento, transferencia ni adsorción a matrices.
Detección lineal de 10 a 100 000 células. Cada paso de un flujo de trabajo para la caracterización de ARN debe ser robusto para funcionar con pocas o muchas células. El kit TaqMan™ PreAmp Cells-to-CT™ se ha optimizado para generar linealidad eficientemente en 5 logaritmos de entrada celular, de 10 a 100 000 células por reacción de lisis (Figura 5). Además, para maximizar la sensibilidad, el kit TaqMan™ PreAmp Cells-to-CT™ permite que hasta el 45 % del volumen de la reacción de RT se componga de lisado de muestra. El kit TaqMan™ PreAmp Cells-to-CT™ proporciona la máxima sensibilidad gracias al gran volumen de lisado utilizado en la reacción de RT, las condiciones optimizadas de la reacción de RT y la preamplificación de la muestra antes de la PCR en tiempo real.
Rendimiento comprobado, comprobado en conjunto. Todos los componentes del kit TaqMan™ PreAmp Cells-to-CT™ se han optimizado para un rendimiento consistente y fiable. Esto elimina las dudas que conlleva el montaje de kits separados de preparación de muestras, RT, preamplificación y PCR en tiempo real. Para mayor garantía de calidad, el kit TaqMan™ PreAmp Cells-to-CT™ se ha validado con los ensayos de expresión génica TaqMan™.
Para usar con (equipo): Sistema 7000, Sistema 7300, Sistema 7500, Sistema 7900HT, Sistema de PCR en tiempo real rápido StepOnePlus™ de Applied Biosystems, StepOne™, Modo estándar, StepOnePlus™, Modo estándar, Sistemas QuantStudio 6 y 7 Pro, Sistema QuantStudio 7 Flex, Sistemas QuantStudio 3 y 5, Sistema QuantStudio 12k Flex, Sistema QuantStudio 6 Flex
Formato: Kit
Características ecológicas: se utilizan menos recursos y se generan menos residuos, son menos peligrosos
Número de reacciones: 40 reacciones
Colorante de referencia pasivo: ROX (premezclado)
Polimerasa: ADN polimerasa
Línea de productos: Ambion™, Cells-to-CT™, TaqMan™
Tipo de producto: Kit de celdas de preamplificador a C
Grado de pureza o calidad: UP (Ultra Puro)
Cantidad: 40 reacciones
Transcriptasa inversa: M-MLV
Tipo de muestra: Célula
Condición de envío: Hielo seco
Suficiente para: 40 reacciones
Método de detección: cebador-sonda
Para usar con (aplicación): preamplificación
Rendimiento de PCR rico en GC: bajo
Método de PCR: RT-qPCR de 2 pasos
Velocidad de reacción: estándar
Tamaño de la unidad: cada una