Thermo Fisher, AM1923, Sistema de aislamiento de ARN total LeukoLOCK™

Sistema de Aislamiento de ARN Total LeukoLOCK™. El Sistema de Aislamiento de ARN Total LeukoLOCK™ es un método innovador para el fraccionamiento celular de sangre completa y la estabilización y extracción de ARN total de la población leucocitaria. El kit consta de un Kit de Fraccionamiento y Estabilización LeukoLOCK™ (también disponible por separado; n.° de cat. AM1933) y un Kit de Aislamiento de ARN Total LeukoLOCK™.
• Fracciona leucocitos de sangre completa en minutos
• Extrae el ARN total de los leucocitos.
• No se requieren pasos adicionales de reducción de globina
• Estabiliza el ARN para preservar el perfil de expresión.
• Conserva los leucocitos a temperatura ambiente durante días. El sistema LeukoLOCK™ está optimizado para su uso con sangre humana. La sangre es un depósito de información celular; sin embargo, la presencia de ARNm de globina en el ARN preparado a partir de sangre completa puede interferir con las aplicaciones posteriores de perfil de expresión. El sistema LeukoLOCK™ emplea tecnología de depleción leucocitaria basada en filtro para aislar los leucocitos de la sangre completa y la solución RNAlater™ para estabilizar las células en el filtro. Al excluir los glóbulos rojos, el ARN purificado de los leucocitos capturados se depleta inherentemente de ARNm de globina, lo que mejora la utilidad de la muestra para el perfil de expresión y otras aplicaciones (véase la figura).
Captura y estabilización de leucocitos. Se pasa una muestra de 9-10 ml de sangre anticoagulada a través de un filtro LeukoLOCK™, que captura la población total de leucocitos y elimina los eritrocitos (incluidos los reticulocitos), las plaquetas y el plasma. Tras enjuagar con solución salina tamponada con fosfato, el filtro se enjuaga con solución RNAlater™ para estabilizar el ARN en los leucocitos capturados (véase el esquema del protocolo). El ARN se puede aislar inmediatamente o las células estabilizadas se pueden mantener durante varios días a temperatura ambiente o durante períodos más prolongados a –20 °C o –80 °C (véase la figura).
Aislamiento de ARN: La purificación del ARN se realiza primero rompiendo las células capturadas en una solución a base de tiocianato de guanidinio, que libera el ARN a la vez que inactiva las nucleasas. El lisado celular se recoge y se trata brevemente con proteinasa K. A continuación, el ARN se purifica del lisado mediante la tecnología de microesferas magnéticas MagMAX™ para el lavado, seguido del tratamiento con DNasa (con TURBO DNase™) y la limpieza final.
Estudios de expresión: Tanto los estudios de expresión mediante RT-PCR cuantitativa como los de microarrays han validado la idoneidad del ARN purificado para la elaboración fiable de perfiles transcriptómicos (véase la figura). En comparación con el ARN procesado con un procedimiento de aislamiento de ARN sanguíneo de uso común, el ARN aislado con el sistema LeukoLOCK™ produce una mediana de ARNa más larga tras la amplificación y un mayor porcentaje de llamadas presentes, sin necesidad de pasos adicionales posteriores a la extracción para eliminar el ARNm de globina (véase la figura). Dado que el ARNa de globina representa entre el 25 % y el 40 % del pico de ARNa del ARN total de sangre completa, el rendimiento de ARN total es comprensiblemente menor con métodos que eliminan los transcritos de globina no deseados. El ARN amplificado tras la purificación con LeukoLOCK™ ofrece una mayor sensibilidad del array debido a la drástica reducción de los transcritos de globina que compiten.
Rendimiento del kit. La recuperación varía según el donante, pero suele ser de 10 a 20 μg de ARN por cada 9 a 10 ml de sangre completa (véase la figura). El ARN recuperado con el sistema LeukoLOCK™ contiene menos de una décima parte de la cantidad de ARNm de alfa y beta-globina derivados de reticulocitos presente en muestras típicas de ARN de sangre completa no fraccionada.
Tipo de producto final: ARN total
Para usar con (aplicación): análisis de microarrays, PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR), PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR), ensayos de protección de nucleasas, transferencia Northern, construcción de bibliotecas de ADNc
Compatibilidad de alto rendimiento: No compatible con alto rendimiento (manual)
Número de reacciones: 20 preparaciones
Escala de preparación: > 1 mL de muestras de sangre (gran escala)
Línea de productos: Ambion™, LeukoLOCK™
Cantidad: 20 preparaciones
Cantidad de material de partida: hasta 10 ml de sangre completa
Tecnología de aislamiento: Filtro de captura de leucocitos, microesferas magnéticas
Tipo de muestra: células, sangre
Objetivo: ARN total
Tamaño de la unidad: cada una