Thermo Fisher, K1032, Kit de carga LiveBLAzer™ FRET-B/G con CCF2-AM

Cantidad: 200 μg. Los ensayos celulares GeneBLAzer™ utilizan las formas éster permeables a la membrana (CCF2-AM y CCF4-AM) de los sustratos de betalactamasa fluorescentes con carga negativa, CCF2 y CCF4. Estos ésteres lipofílicos entran fácilmente en la célula, donde la escisión por esterasas citoplasmáticas endógenas los convierte rápidamente en sus formas con carga negativa, atrapándolos así en el citosol.
La detección mediante ensayos GeneBLAzer™ se basa en la técnica FRET. Cada sustrato se marca con dos fluoróforos que forman un par FRET eficiente. En ausencia de actividad de betalactamasa, la excitación de la cumarina a 409 nm en la molécula intacta de CCF2 produce FRET a la fluoresceína, que emite una señal de fluorescencia verde a 518 nm (Figura 1). Sin embargo, en presencia de actividad de betalactamasa, la escisión de CCF2 separa espacialmente los dos colorantes y altera la FRET, de modo que la excitación de la cumarina a 409 nm produce una señal de fluorescencia azul a 447 nm. Esta señal azul se puede observar fácilmente al microscopio y también se detecta como un aumento en la lectura del canal azul en los lectores de microplacas fluorescentes.
Los sustratos CCF2-AM y CCF4-AM son componentes esenciales de la plataforma GeneBLAzer™. Estos sustratos son totalmente compatibles con la citometría de flujo, lo que acelera la selección de clones. El análisis ratiométrico de las señales azul y verde reduce la variación entre pocillos debido a las diferencias en el número de células y la carga de sustrato, lo que resulta en valores altos del factor Z' y coeficientes de variación (CV) bajos.
CCF2-AM y CCF4-AM se diferencian por dos carbonos en el puente que une la fracción de cumarina con el anillo de lactama. Ambos se encuentran en formas esterificadas, permeables a la membrana, y pueden utilizarse en ensayos en células intactas. CCF4-AM presenta mejores propiedades de solubilidad (soluble durante más de 24 horas) que CCF2-AM, por lo que es ideal para aplicaciones de cribado. Además, CCF4-AM presenta una FRET ligeramente mejor y, por lo tanto, un fondo ligeramente inferior al de CCF2-AM.
CCF2-FA es esencialmente el sustrato de CCF2 sin los ésteres presentes en la versión AM. CCF2-FA se desesterifica y se utiliza en lisados ​​celulares, evitando la carga a través de la membrana celular y los pasos de desesterificación. Los lisados ​​celulares son el método preferido para aplicaciones que utilizan células con pared celular. CCF2-FA también puede utilizarse como control para adquirir los espectros de excitación y emisión de CCF2-AM y CCF4-AM.
Permeabilidad celular: permeable a las células
Para usar con (equipo): citómetro de flujo, lector de microplacas
Línea de productos: LiveBLAzer™
Cantidad: 200 μg
Sustrato: CCF2-AM
Propiedades del sustrato: Sustrato químico
Tipo de sustrato: Sustrato de beta-lactamasa
Método de detección: fluorescencia
Tipo: Kit de carga FRET-B/G
Tamaño de la unidad: cada una