Thermo Fisher, L150201, Kit GeneRacer™ con SuperScript™ III RT y TOPO TA Cloning™ Kit para secuenciación

Kit GeneRacer™ con SuperScript™ III RT y TOPO TA Cloning™ para secuenciación. El kit GeneRacer™ proporciona un método para obtener los extremos 5' y 3' completos del ADNc utilizando secuencias de ADNc conocidas de etiquetas de secuencia expresadas (EST), ADNc sustraído, visualización diferencial o cribado de bibliotecas. El kit garantiza la amplificación únicamente de transcripciones completas mediante la eliminación de mensajes truncados del proceso de amplificación. Los productos de PCR RACE se pueden clonar rápida y fácilmente utilizando el kit de clonación PCR Zero Blunt™ TOPO™ para secuenciación (productos de PCR de extremos romos) o el kit de clonación PCR TOPO TA (productos de PCR con salientes A 3'). Utilizando los protocolos proporcionados, los extremos de ADNc de transcripciones raras (30 copias/célula) y largas (9 kb) se pueden amplificar y secuenciar a partir de 1 μg de ARN total. Con el kit GeneRacer™ puedes:
• Generar ADNc a partir de transcripciones de al menos 10 kb de longitud
• Obtener el extremo 5' completo de transcripciones raras a menos de 30 copias por célula
• Clone los extremos 5' y 3' completos para construir la secuencia completa de ADNc. SuperScript™ III RT. El kit GeneRacer™ está disponible con la transcriptasa inversa (RT) SuperScript™ III para una mejor amplificación del extremo 5' completo de ARNm largo y complejo. La porción de ARNasa H de SuperScript™ III RT ha sido mutada para evitar la escisión del ARNm durante la síntesis de ADNc. Esto aumenta el tamaño y la producción de ADNc. SuperScript™ III RT es más termoestable que las RT de tipo salvaje. Esto permite la transcripción inversa a temperaturas más altas, relajando la estructura secundaria de plantillas complejas y permitiendo que la síntesis de ADNc se complete. Cómo funciona el kit GeneRacer™. El kit GeneRacer™ garantiza que solo se amplifiquen las transcripciones que contienen extremos de ADNc completos (ver figura). El protocolo avanzado comienza a nivel de ARN, dirigiéndose específicamente solo al ARNm con capuchón 5'. En los pasos subsiguientes, se retira la tapa y se reemplaza con el GeneRacer™ RNA Oligo. Durante la transcripción inversa, la secuencia del GeneRacer™ RNA Oligo se incorpora al ADNc. Solo el ADNc que se transcribe inversamente por completo contendrá esta secuencia conocida. Luego se realiza la PCR 5' RACE utilizando el GeneRacer™ 5' Primer específico para la secuencia del GeneRacer™ RNA Oligo y un cebador específico del gen. El resultado es ADN amplificado que contiene la secuencia completa del ADNc 5'. Sensibilidad y longitud Para demostrar la capacidad del GeneRacer™ Kit para capturar el extremo 5' del ADNc de longitud completa, se amplificaron los extremos 5' de los genes con sitios de inicio de la transcripción conocidos. Comenzando con el ARN total y siguiendo el protocolo GeneRacer™, se amplificaron tanto las transcripciones largas (10 kb) como los mensajes raros presentes al 0,01 %, o 30 copias por célula (ver figura). Cepa bacteriana o de levadura: TOP10
Método de clonación: TOPO TA
Para usar con (aplicación): Transcripción inversa
Incluye: Módulo GeneRacer: 2 x 1,5 ml de agua estéril, 24 μl de RNaseOut, 6 μl de cada una de fosfatasa intestinal de ternera (CIP), tampón CIP, pirofosfatasa ácida del tabaco (TAP), tampón TAP 10X, ligasa de ARN T4, tampón de ligasa de ARN T4 10X y 10 mM de ATP, 6 x 250 ng de oligonucleótido GeneRacer de ARN, 2 x 1 ml de fenol/cloroformo, 36 μl de glucógeno de mejillón, 200 μl de acetato de sodio (3 M), 225 μl de cada uno de los siguientes cebadores GeneRacer 5', cebador anidado 5', cebador 3' y cebador anidado 3', 20 μl de ARN total HeLa de control (500 ng/μl), 15 μl de cada cebador de control A y cebador de control B.1; Módulo RT SuperScript III: 6 μL de transcriptasa inversa SuperScript III (200 U/μL), 24 μL de tampón de primera cadena 5X, 15 μL de DTT (0,1 M), 6 μL de ARNasa H (2 U/μL), 6 μL de cebadores aleatorios (100 ng/μL), 6 μL de cebador GeneRacer Oligo dT (900 ng/μL), 6 μL de mezcla de dNTP (10 mM cada uno), 10 columnas SNAP, kit de clonación TOPO TA para secuenciación (-20 °C), reactivos suficientes y una solución de E. coli químicamente competente TOP10 de una sola toma.
Línea de productos: GeneRacer™, SuperScript™, TA Cloning™, TOPO™
Tipo de producto: Kit de clonación
Cantidad: 1 Kit
Vector: pCR4-TOPO TA
Formato: Kit
Tamaño de la unidad: cada una