Enzimas e inhibidores Thermo Fisher para PCR, clonación y protección de proteínas

Desde la PCR rutinaria hasta la preparación de ARN y estudios de fosfoseñalización, necesita enzimas que catalicen reacciones limpias e inhibidores que protejan las muestras. Esta colección organiza las soluciones de Thermo Fisher por tarea para que pueda elegir rápidamente. Como distribuidor autorizado, Iright ofrece una amplia gama de productos Thermo Fisher con disponibilidad inmediata.

¿Qué son las enzimas y los inhibidores en la biología molecular?

Las enzimas aquí impulsan las reacciones de laboratorio esenciales (corte, copia, unión o recorte de ácidos nucleicos), mientras que los inhibidores bloquean las actividades no deseadas que degradan los resultados. Considere polimerasas de alta fidelidad para una amplificación precisa, enzimas de restricción FastDigest para digestores rápidos y combinaciones de inhibidores de ARNasa/proteasa/fosfatasa para proteger el ARN frágil y las modificaciones postraduccionales.

Familias de productos: polimerasas, enzimas de restricción, ligasas e inhibidores de ARNasa/proteasa

Para reducir el tiempo de selección, comience con la familia que se ajuste a su flujo de trabajo. Revise la breve descripción general para ver si se ajusta y luego vaya a los SKU representativos que puede agregar a carritos o solicitudes de presupuesto sin salir de la página.

Polimerasas de PCR y RT : Elija química de alta fidelidad para clonación y variantes, u opciones de arranque en caliente para suprimir la amplificación inespecífica. Entre las opciones más representativas se incluyen la ADN polimerasa de alta fidelidad Thermo Scientific Phusion (Cat. F530S , F530L ) y la ADN polimerasa Invitrogen Platinum SuperFi II (Cat. 12361010 , 12361050 ).

Enzimas de restricción (serie FastDigest) : Digestiones rápidas en 5-15 minutos con un tampón universal que optimiza las digestivas simples o dobles, minimizando los cambios de tampón y el riesgo de actividad estrella. Ejemplo: FastDigest XbaI (Cat. FD0684 , FD0685 ).

Ligadura de ADN : Ligadura robusta para extremos cohesivos/romos y reparación de mellas. Entre las opciones más populares se encuentra la ligasa de ADN Thermo Scientific T4 (cat. EL0011 , EL0014 ).

Protección del ARN : Mantenga las ARNasas A/B/C a raya durante la extracción y la RT. El inhibidor de ARNasa RiboLock (40 U/µL) está disponible en prácticos tamaños de envase (Cat. EO0381 , EO0382 , EO0384 ).

Protección de proteínas : conserve las proteínas y los estados de fosforilación directamente desde la lisis con los cócteles inhibidores de proteasa y fosfatasa Halt , incluidas las variantes sin EDTA para ensayos dependientes de metales (Cat. 78440 , 78442 , 78443 ).

Guía de selección rápida: Elija la polimerasa, enzima de restricción o cóctel inhibidor adecuado

Cuando las opciones parezcan similares, alinee la elección con su objetivo y limitaciones. La matriz a continuación combina tareas comunes con tipos recomendados y notas prácticas, para que pueda pasar de la pregunta al carrito con decisión.

Buffers y compatibilidad: digestión doble, preparación para la ligadura e inhibidores seguros para EDTA

Los tampones determinan la velocidad, el riesgo de actividad estelar y el éxito posterior. Las enzimas FastDigest comparten un tampón universal, lo que permite combinar dos enzimas sin cambiar de tampón y finalizar en minutos, lo que también mejora la transferencia de la ligadura. Para la lisis, los cócteles de inhibidores sin EDTA evitan la quelación de cofactores metálicos en ensayos o fosfatasas que podrían necesitarse posteriormente.

Niveles de rendimiento: Taq de alta fidelidad vs. Taq estándar, opciones de arranque en caliente y grados

Adapte el rendimiento a la decisión que toma con los datos. Las polimerasas de alta fidelidad como Platinum SuperFi II y Phusion reducen los errores de clonación y la llamada de variantes; las formulaciones de inicio en caliente frenan la amplificación inespecífica cuando la configuración de la reacción o el contenido del GC son complejos. Los tampones de anexión universal simplifican el diseño de cebadores a 60 °C para una PCR básica.

Almacenamiento, envío y manipulación: cadena de frío, estabilidad y consejos de congelación y descongelación

El envío y el almacenamiento protegen la actividad tanto como la formulación. Consulte la ficha técnica para conocer la temperatura y la estabilidad; los cócteles de inhibidores como Halt se almacenan a 4 °C , mientras que muchas enzimas se envían en frío y se mantienen congeladas para minimizar la pérdida de actividad. Cuando sea posible, utilice alícuotas para reducir los ciclos de congelación y descongelación y mantenga las soluciones tampón bien tapadas.

Miniprotocolos: PCR de alta concentración de GC, doble digestión rápida + ligadura, uso de inhibidores de ARNasa/proteasa

Estas recetas cortas, fáciles de copiar y pegar, cubren configuraciones comunes y ayudan a los principiantes a familiarizarse con la hoja de datos en una sola pasada. Ajuste el volumen según el tamaño del tubo y consulte las notas específicas del producto en la página del producto antes del primer uso.

PCR de alta GC (25 µL, SuperFi II/Phusion)

1. Mezcle la mezcla maestra de polimerasa según la hoja de datos; agregue 0,5 µM de cebadores, 200 µM de dNTP y 1–10 ng de gDNA/cDNA.

2. Desnaturalización inicial según lo recomendado; ciclo de desnaturalización a 98 °C, recocido universal a 60 °C o basado en Tm y extensión a 72 °C (15–30 s/kb).

3. Terminar con 72 °C 5 min; mantener a 4 °C; analizar en agarosa.

Digestión doble rápida → ligación (FastDigest + Ligasa T4)

1. Digerir 0,5–1 µg de plásmido/inserto con dos enzimas FastDigest en tampón universal, 37 °C durante 10–30 min.

2. Inactivar por calor o purificar si es necesario; establecer la ligadura con ADN Ligasa T4 en las proporciones y temperatura recomendadas.

3. Transformar; placa y pantalla.

Uso del inhibidor de la ARNasa (RiboLock)

1. Agregue según la hoja de datos la U/µL final a las reacciones de extracción o RT.

2. Mantenga las soluciones libres de ARNasa; evite ciclos repetidos de calor y frío.

3. Proceder a la síntesis de ADNc o PCR posterior.

Adición de cócteles inhibidores de proteasa/fosfatasa (Halt)

1. Diluir el tampón de lisis a 1× justo antes de usar (sin EDTA para ensayos dependientes de metales).

2. Mantenga las muestras frías; acorte el tiempo de clarificación.

3. Proceda a la preparación para BCA, Western o MS según el protocolo.

Preguntas frecuentes: Elección de polimerasa, inhibidores de ARNasa/proteasa/fosfatasa, resolución de problemas de ligadura

La mayoría de los retrasos en las compras se deben a las mismas preguntas. Usa estas respuestas rápidas para avanzar y consulta la página del producto cuando necesites especificaciones detalladas.

¿Realmente necesito alta fidelidad para la PCR de rutina?
Si va a clonar o secuenciar el amplicón, sí, las tasas de error aumentan posteriormente. Use SuperFi II o Phusion; solo para el cribado, una Taq estándar puede ser suficiente.

¿Pueden las enzimas FastDigest realmente realizar una doble digestión sin intercambios de buffer?
Sí, FastDigest comparte un tampón universal diseñado para digestos simples o combinados en 5 a 15 minutos ; verifique la sensibilidad a la metilación de su sitio.

¿Cuándo debo elegir cócteles inhibidores sin EDTA?
Elija sin EDTA cuando los ensayos dependan de iones metálicos (p. ej., metaloproteasas, ensayos de quinasas). De lo contrario, las combinaciones estándar ofrecen una amplia protección.

¿Por qué mi ligadura es pobre y tiene puntas romas?
Aumente la proporción de inserto:vector, verifique el ATP en el tampón de ligasa y confirme la temperatura/tiempo. Si es necesario, pula los extremos o utilice estrategias de extremos cohesivos.

¿Son los inhibidores de ARNasa compatibles con los detergentes?
La mayoría de los flujos de trabajo son compatibles con las concentraciones finales recomendadas; confirme las notas del producto si utiliza surfactantes agresivos.

Obtenga enzimas e inhibidores Thermo Fisher de Iright (Presupuesto y disponibilidad)

Díganos qué está desarrollando (cribado de clones, protección de ARN o preservación de fosfoseñales) y encontraremos el stock adecuado para su protocolo. Iright puede suministrar polimerasas Thermo Fisher , enzimas FastDigest, ligasas y cócteles de inhibidores en diversos tamaños de envase, con la documentación lista para sus notas de compra.